Undecaprenylphosphat-Translokasen verleihen eine bedingte mikrobielle Fitness

Nature Band 613, Seiten 721–728 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die mikrobielle Zellwand ist für die Aufrechterhaltung der Zellform und die Widerstandsfähigkeit gegenüber äußeren Stressfaktoren unerlässlich1. Der primäre Strukturbestandteil der Zellwand ist Peptidoglycan, ein Glykopolymer mit Peptidvernetzungen außerhalb der Zellmembran1. Die Biosynthese und Struktur von Peptidoglycanen reagieren auf sich ändernde Umweltbedingungen wie pH-Wert und Salzgehalt2,3,4,5,6, aber die Mechanismen, die solchen Anpassungen zugrunde liegen, sind unvollständig verstanden. Vorläufer von Peptidoglycan und anderen Zelloberflächen-Glykopolymeren werden im Zytoplasma synthetisiert und dann über die Zellmembran transportiert, gebunden an den wiederverwertbaren Lipidträger Undecaprenylphosphat7 (C55-P, auch bekannt als UndP). Hier identifizieren wir die DUF368-haltigen und DedA-Transmembranproteinfamilien als mögliche C55-P-Translokasen und schließen damit eine kritische Wissenslücke über die Proteine, die für die Biogenese mikrobieller Zelloberflächenpolymere erforderlich sind. Gramnegative und grampositive Bakterien, denen ihr zugehöriges DUF368-haltiges Protein fehlt, zeigten alkaliabhängige Zellwand- und Lebensfähigkeitsdefekte sowie erhöhte C55-P-Spiegel auf der Zelloberfläche. pH-abhängige synthetische genetische Wechselwirkungen zwischen DUF368-haltigen Proteinen und Mitgliedern der DedA-Familie legen nahe, dass die Nutzung des C55-P-Transporters dynamisch ist und durch Umwelteinflüsse moduliert wird. Die Aktivität des C55-P-Transporters wurde vom Cholera-Erreger für das Wachstum und die Aufrechterhaltung der Zellform im Darm benötigt. Wir gehen davon aus, dass die bedingte Transporterabhängigkeit für Widerstandsfähigkeit beim Lipidträgerrecycling sorgt und die mikrobielle Fitness sowohl innerhalb als auch außerhalb des Wirts stärkt.

Phosphorylierte Undecaprenyl (C55)-Lipide spielen eine wesentliche Rolle als recycelbare Trägermoleküle bei der Glykopolymer-Biogenese mikrobieller Zelloberflächen7. Während der Peptidoglycan-Biosynthese werden die zuckergebundenen Pentapeptid-Untereinheiten des Peptidoglycans, die im bakteriellen Zytoplasma zusammengesetzt werden, für den Transmembrantransport kovalent an C55-P gebunden7 (Abb. 1a). Nachdem der trägergebundene Peptidoglycan-Vorläufer (Lipid II) durch MurJ8 von der inneren zur äußeren Membranmembran bewegt wurde, hinterlässt der anschließende Einbau des Muropeptids in polymerisiertes Peptidoglycan C55-Pyrophosphat (C55-PP). Das Trägerrecycling wird durch Hydrolyse von C55-PP zu C55-P durch membranassoziierte Phosphatasen eingeleitet, darunter UppP (auch bekannt als BacA) und die PAP2-Domänenproteine ​​PgpB, YbjG und LpxT7. Anschließend wird C55-P vermutlich in die zytosolische Seite der Membran zurückgeschleust, um das Recycling abzuschließen. Vorläufige Strukturstudien deuten darauf hin, dass UppP möglicherweise auch als C55-P-Translokase fungiert9,10, die für die C55-P-Internalisierung verantwortlichen Proteine ​​wurden jedoch noch nicht identifiziert. Das C55-P-Recycling ist ein wichtiger Schritt in der Biosynthese von Peptidoglycan sowie anderen Zelloberflächen-Glykopolymeren, einschließlich Wandteichonsäuren, bestimmten Lipopolysaccharidmodifikationen und Kapseln7. Aufgrund seiner weitreichenden und entscheidenden Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zelloberfläche gilt das C55-P-Recycling als wichtiges Ziel für antimikrobielle Therapien, und es wurden natürlich vorkommende Antibiotika identifiziert, die diesen Prozess hemmen11.

a, Verwendung und Recycling von C55-P in Bakterien. Für Abb. 3 relevante Wirkungsorte des Antibiotikums sind durch rote Balken gekennzeichnet. Gestrichelte Pfeile stellen mehrere Enzym- und/oder Transportschritte dar. Das graue Sechseck stellt variable Zucker dar, die für den nachgeschalteten Glykopolymeraufbau an C55-P gebunden sind. LPS, Lipopolysaccharid; PG, Peptidoglycan. b, Konservierung von DUF368 in ausgewählten Bakterienstämmen (aufrecht) und Gattungen (kursiv). Die farbigen Segmente und zugehörigen Beschriftungen kennzeichnen ausgewählte Phyla mit erheblicher DUF368-Erhaltung. Der Anteil der sequenzierten einzigartigen Clade-Genome, die ein DUF368-haltiges Protein kodieren, ist angegeben. c,d, Vorhergesagte bandförmige (c) und elektrostatische oberflächengefärbte (d) Strukturen von VCA0040. Farbskala, −10 bis 10 kcal (mol e−). e,f, Wachstum (e) und Morphologie (f) von Wildtyp (WT), Δvca0040 und Δvca0040 + vca0040 (chromosomal komplementiert) V. cholerae in LB-Medium. g, Mittlerer pH-Wert von V. cholerae-Übernacht-LB-Kulturen. h, V. cholerae-Wachstum in M9-Medium, gepuffert auf den angegebenen pH-Wert. i, Die Auswirkungen von gepuffertem verbrauchtem Überstand (zellfreies Medium nach 24-stündigem Wachstum bei 30 °C aus einer 1:1.000-Kultur) auf die Morphologie von V. cholerae in der logarithmischen Phase. j, Die Auswirkungen des pH-Werts auf das Wachstum von V. cholerae (oben) und die Morphologie (unten) während der Log-Phase in LB-Medium, gepuffert mit 50 mM Na2HPO4. Hinweis: ungepuffertes Medium. e,g,h, Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 3 Kulturen pro Stamm oder Zustand. f,i,j, Repräsentative Bilder von n = 3 Kulturen pro Stamm oder Zustand. Maßstabsbalken, 3 μm (f) und 5 μm (i,j).

Vibrio cholerae, der gramnegative Erreger der Durchfallerkrankung Cholera, ist beim Eintritt, Durchgang und Austritt in den Magen-Darm-Trakt des Wirts dramatischen Veränderungen des pH-Werts und der Ionenkonzentration ausgesetzt. Eine Vielzahl von Sensor- und Signalnetzwerken ermöglichen es V. cholerae, sich an veränderte Umgebungen anzupassen. Beispielsweise reagiert der Krankheitserreger auf veränderte Salzgehalte und pH-Werte, indem er eine Natriumantriebskraft (SMF) anstelle einer Protonenantriebskraft (PMF) nutzt, um die Proteinsekretion und die Flagellen-abhängige Motilität anzutreiben und die Expression von Virulenzgenen zu regulieren12,13. Es wird angenommen, dass die Peptidoglycan-Zusammensetzung von V. cholerae durch Umwelteinflüsse beeinflusst wird, die Auswirkungen des pH-Werts auf die Zellwandbiologie von V. cholerae sind jedoch unbekannt14.

Ein kürzlich durchgeführtes In-vivo-Transposon-Insertions-Sequenzierungsscreening für Determinanten der Darmbesiedlung in einem aktuellen klinischen V. cholerae-Isolat identifizierte zahlreiche Gene, die zuvor nicht mit der Pathogenese von V. cholerae in Verbindung gebracht wurden, darunter mehrere Loci mit unbekannter Funktion15 (Extended Data Abb. 1a). Eines dieser Gene, vca0040 (N900_RS14215), wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt, da ähnliche Datensätze16, 17, 18 auf eine universelle Anforderung dieses Gens bei der Darmkolonisierung durch V. cholerae schließen ließen. Es wird vorhergesagt, dass VCA0040 ein Multi-Pass-Innenmembranprotein ist und die weitgehend konservierte Domäne unbekannter Funktion DUF368 (auch bekannt als PF04018) enthält (Abb. 1b und erweiterte Daten Abb. 1b – e). Das vorhergesagte Strukturmodell von VCA0040 weist eine große mutmaßliche Spalte auf, die für Domänen mit Ligandenbindungs- und/oder Transportaktivität charakteristisch ist (Abb. 1c, d und erweiterte Daten Abb. 2). Ein V. cholerae-Stamm, dem VCA0040 (Δvca0040) fehlte, zeigte einen Wachstumsdefekt in der stationären Phase (Abb. 1e und erweiterte Daten, Abb. 3a), der von einem ausgeprägten Zellform-Phänotyp begleitet war, bei dem Δvca0040-Zellen zu großen Kugeln wurden (Abb. 1f und erweiterte Daten). Abb. 3b,c). Diese kugelförmigen V. cholerae waren lebensfähig und führten zu normalen stäbchenförmigen Tochterzellen (Extended Data Abb. 3d).

Wir gingen davon aus, dass ein stationärer phasenspezifischer Faktor den Formdefekt in Δvca0040-Zellen auslösen könnte. Dementsprechend induzierte die Exposition exponentiell wachsender Δvca0040-Zellen gegenüber zellfreien verbrauchten Überständen aus Kulturen in der stationären Phase schnell die Bildung von Kugeln (Extended Data, Abb. 3e). Hitzelabile und hochmolekulare Faktoren sowie d-Aminosäuren, die die Peptidoglycan-Zusammensetzung in der stationären Phase modulieren, wurden als Kandidaten ausgeschlossen (Extended Data Abb. 3e, f). In LB-Kulturen geht der Eintritt von V. cholerae in die stationäre Phase mit einer Alkalisierung des Mediums einher (Abb. 1g). Da im neutral gepufferten M9-Medium nur minimale Formfehler beobachtet wurden (Extended Data Abb. 3b), nahmen wir an, dass Δvca0040-Zellen alkaliempfindlich waren. Das Puffern von M9-Medien auf unterschiedliche pH-Werte zeigte einen Wachstumsdefekt bei pH 8, jedoch nicht bei pH 6 oder pH 7, und die Ansäuerung des zellfreien, verbrauchten Überstands beseitigte den Phänotyp der Kugelinduktion (Abb. 1h, i). In gepuffertem LB zeigten Δvca0040-Zellen Wachstums- und Zellformdefekte bei pH über 8, jedoch nicht bei pH-Werten von bis zu 7 (Abb. 1j). Daher ist das DUF368-haltige Protein VCA0040 für die Integrität und das Wachstum der Zellform von V. cholerae unter alkalischen Bedingungen erforderlich.

DUF368-Domänen sind in den Vibrionaceae fast überall konserviert und kommen in Tausenden weiterer gramnegativer, grampositiver und archaischer Arten vor, die eine Vielzahl von Nischen bewohnen (Ergänzungstabellen 1 und 2). Die heterologe Expression von grampositiven (Staphylococcus aureus) oder archaealen (Haloferax volcanii) DUF368-Homologen ergänzte zumindest teilweise den alkalischen Wachstumsdefekt von Δvca0040 V. cholerae-Zellen (Extended Data Abb. 4a, b). Beide Homologen zeigten eine starke vorhergesagte strukturelle Ähnlichkeit mit VCA0040, was darauf hindeutet, dass die Funktion des DUF368-haltigen Proteins nicht nur zwischen gramnegativen und grampositiven Spezies, sondern über mikrobielle Königreiche hinweg erhalten bleibt (Extended Data, Abb. 2).

Da Peptidoglycan für die Aufrechterhaltung der bakteriellen Zellform erforderlich ist, stellten wir die Hypothese auf, dass die Funktionen von DUF368 die Zellwand beeinflussen. Die Δvca0040-Mutante hatte 1,5–2× weniger Peptidoglycan als der Wildtyp und mäßige Vernetzungsdefekte bei gleichzeitiger Akkumulation des Peptidoglycan-Vorläufers UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid (UDP-M5), was auf einen Peptidoglycan-Biosynthesedefekt vor der Kreuzvernetzung hindeutet. Verknüpfung (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 4c–e). Diese Phänotypen traten bei neutralem pH-Wert auf und wurden durch die Einwirkung alkalischer Bedingungen verstärkt. In Übereinstimmung mit der Annahme, dass die DUF368-Funktion erhalten bleibt, wies S. aureus ohne SAOUHSC_00846 auch einen alkalischen Wachstumsdefekt, eine verringerte Peptidoglykanmenge, eine Anreicherung von UDP-M5 und eine verringerte Vernetzung auf (Abb. 2c – e und erweiterte Daten Abb. 4f, g). ). Wir kamen aus diesen Daten zu dem Schluss, dass DUF368-haltige Proteine ​​unbedingt erforderlich sind, um die Peptidoglycan-Produktion und -Zusammensetzung aufrechtzuerhalten.

a,b, Gesamtpeptidoglycan (a) und intrazelluläres UDP-M5 (b) in V. cholerae, gezüchtet in M63-Minimalmedium bei dem angegebenen pH-Wert. Suppressor, Δvca0040/ΔsecDF1. c, Alkalisches Wachstum von ΔSAOUHSC_00846 (Δ0846) S. aureus unter den angegebenen Bedingungen und mit den angegebenen Expressionsvektoren. Repräsentative Ergebnisse aus n = 3 unabhängigen Experimenten pro Bedingung. d,e, Gesamtpeptidoglycan (d) und intrazelluläres UDP-M5 (e) in S. aureus, gewachsen in tryptischer Sojabrühe (TSB) mit 100 mM Bicin bei dem angegebenen pH-Wert. a,b,d,e, n = 3 Kulturen pro Stamm oder Zustand; Die Daten sind Mittelwerte ± sd a,b, einfaktorielle ANOVA mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest. d,e, zweiseitiger t-Test des ungepaarten Studenten.

Zwei weitere Beobachtungen konzentrierten unsere Untersuchung der DUF368-Domänen auf den Zellwandaufbau. Zunächst beobachteten wir, dass, obwohl die meisten DUF368-haltigen Proteine ​​hauptsächlich aus einer oder zwei DUF368-Domänen bestehen, mehrere Mikroorganismen Dual-Domänen-Proteine ​​mit DUF368-PAP2-, PAP2-DUF368- oder DUF368-BacA-Architekturen kodieren (Ergänzungstabelle 3). Zweitens kam es während der Kugelbildung in Δvca0040 V. cholerae zu einer etwa zehnfachen Induktion von pgpB, das für eine C55-PP-Phosphatase20 kodiert (Extended Data Abb. 5a – d und Ergänzungstabelle 4). Trotz dieser Assoziationen von DUF368 mit C55-bezogenen Prozessen zeigte die Δvca0040-Mutante nur geringfügige (bis zu 4-fache) Erhöhungen der minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) einer Reihe von Peptidoglycan-zielenden Antibiotika, wahrscheinlich weil die meisten auf die Zellwand wirkenden Verbindungen nicht eindringen können die gramnegative Außenmembran (Ergänzungstabelle 5). Dementsprechend ergab das MIC-Screening in S. aureus, dass die ΔSAOUHSC_00846-Mutante unter alkalischen Bedingungen weitaus empfindlicher (mehr als 64-fach) gegenüber Amphomycin war als der Wildtyp (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 5). Amphomycin ist ein Ca2+-abhängiges Lipopeptid-Antibiotikum, das spezifisch C55-P im äußeren Blättchen der Zytoplasmamembran bindet und dessen Recycling hemmt21,22,23 (Abb. 1a). In Übereinstimmung mit unseren vorherigen Daten (Abb. 2d, e) ist bekannt, dass Amphomycin die Akkumulation von UDP-M5 induziert und die Peptidoglycan-Vernetzung in S. aureus verringert . Der ΔSAOUHSC_00846-Mutant war zusätzlich mäßig sensibilisiert gegen Tunicamycin, das die ersten festgelegten und C55-P-abhängigen Schritte der Wandteichonsäure- und Peptidoglycan-Synthese hemmt, sowie gegen Bacitracin, das C55-PP bindet und die C55-P-Erzeugung auf der extrazytosolischen Seite verhindert die Membran25,26 (Abb. 1a und 3a). Die MHKs für andere auf Peptidoglycane abzielende Moleküle wie Fosfomycin wurden minimal verändert (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 5). Um die DUF368-Funktion in einem gramnegativen Organismus zu testen, exprimierten wir SAOUHSC_00846 oder vca0040 heterolog im für die äußere Membran durchlässigen – und damit Amphomycin-sensibilisierten – Escherichia coli-Stamm lptD421327 (Ergänzungstabelle 5). Die Expression eines der DUF368-haltigen Proteine ​​in lptd4213 E. coli verlieh Amphomycin-Resistenz (Ergänzungstabelle 5). Da E. coli ein endogenes DUF368-haltiges Protein fehlt, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die DUF368-Funktion für eine Resistenz gegen ein Oberflächen-C55-P-Targeting-Antibiotikum ausreicht.

a, Fold Change (FC) der MHK für ΔSAOUHSC_00846 S. aureus unter den angegebenen Bedingungen. Amphomycin*, Amphomycin mit 1 mM CaCl2. b, Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UPLC)-Spuren von gereinigten C55-OH- (a) und C55-P-Standards (b) (oben), Wildtyp-S.-aureus-Lipidextrakte, versetzt mit jedem Standard (Mitte) oder Wildtyp S. aureus behandelt mit 50 μg ml−1 Amphomycin (unten). Rt, Retentionszeit. c, UPLC-Spuren von Lipidextrakten von Wildtyp oder mutiertem S. aureus, gewachsen in TSB pH 7 (oben) oder pH 8,5 (unten). d,e, Relative Häufigkeit von C55-OH (d) und C55-P (e) unter den gleichen Bedingungen wie in c. f, UPLC-Spur von Lipidextrakten von komplementiertem ΔSAOUHSC_00846 S. aureus, gewachsen in TSB pH 8,5. g,h, Rohpeakanteile von C55-OH (g) und C55-P (h) in jedem bei pH 8,5 gewachsenen Stamm. i, S. aureus, gefärbt mit Ampho-FL bei pH 8,5. Maßstabsbalken, 5 μm. DIC, Differential-Interferenz-Kontrastbild. j, Quantifizierung des Ampho-FL-Signals. Symbole stellen die mittlere Ampho-FL-Intensität von 1 bis 8 einzelnen Bakterienclustern in unabhängigen Kulturen dar. k, Vorgeschlagenes Modell für gestörtes C55-P-Recycling und die damit verbundenen Folgen bei Bakterien ohne C55-P-Translokaseaktivität. b,c,f,i, Repräsentative Daten von n = 3 Kulturen pro Stamm oder Zustand. d,e,g,h,j, Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 3–5 Kulturen pro Stamm oder Zustand. Jeder Punkt ist eine unabhängige Kultur. d,e, zweiseitiger t-Test für ungepaarte Schüler. g,h,j, einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichstest.

Die Daten zur Peptidoglycan-Zusammensetzung und Antibiotika-Empfindlichkeit lassen indirekt darauf schließen, dass das C55-P-Recycling in der ΔSAOUHSC_00846-Mutante, insbesondere bei der C55-P-Reinternalisierung, beeinträchtigt war. Um diese Idee weiter zu untersuchen, haben wir C55-Spezies in Membranlipidextrakten aus Wildtyp- und ΔSAOUHSC_00846-Kulturen quantifiziert. Die Amphomycin-Behandlung von Wildtyp-S. aureus führte zu einer deutlichen Akkumulation sowohl von C55-P als auch des auf Gram-Positiv beschränkten C55-P-Vorläufers C55-OH28 (Undecaprenol, auch bekannt als UndOH) (Abb. 3b). Dieser Phänotyp wurde in ΔSAOUSHC_00846 S. aureus-Zellen repliziert, die in alkalischem Medium gezüchtet wurden, jedoch nicht unter neutralen Bedingungen (Abb. 3c – e) oder in einem komplementären Stamm (Abb. 3f – h), was einen direkten Beweis dafür liefert, dass die C55-P-Homöostase damit zusammenhängt an SAOUSHC_00846. Wir beobachteten auch ähnliche alkaliabhängige Anstiege von C55-P (aber nicht C55-OH) in Δvca0040 V. cholerae (Extended Data Abb. 5e, f). Um C55-P im äußeren Blatt der Zellmembran spezifisch zu quantifizieren, haben wir Fluorescein-konjugiertes Amphomycin (Ampho-FL) synthetisiert und es zur Markierung lebender Bakterienzellen verwendet29. Ampho-FL-markierter ΔSAOUHSC_00846 S. aureus zeigte im Vergleich zu Wildtyp-Bakterien in alkalischen Medien ein erhöhtes Signal, was zeigt, dass die C55-P-Spiegel an der Oberfläche in der Mutante bedingt erhöht sind (Abb. 3i, j und erweiterte Daten Abb. 5g, h). . Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass die alkalische Anreicherung von Oberflächen-C55-P in DUF368-haltigen Proteinmutanten einen kompensatorischen – aber letztendlich unzureichenden – Anstieg der C55-P-Synthese hervorruft, was zu Defekten bei der Produktion von Oberflächen-Glykopolymeren und beeinträchtigtem Wachstum führt (Abb. 3k). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einem Modell, bei dem DUF368-haltige Proteine ​​C55-P-Recyclingtransporter sind, die unter alkalischen Bedingungen aktiv sind.

Da angenommen wird, dass das C55-P-Recycling eine wesentliche Funktion ist und DUF368-Mutanten bedingt lebensfähig waren, führten wir als nächstes ein synthetisches Transposon-Screening durch, um das genetische Netzwerk von vca0040 zu definieren. Viele der identifizierten synthetischen kranken oder tödlichen Wechselwirkungen standen im Zusammenhang mit der Homöostase der Zellhülle (Abb. 4a und Ergänzungstabelle 6). Die stärkste Wechselwirkung von vca0040 fand mit N900_RS16280 (auch bekannt als vca0534) statt, das ein Homolog des E. coli-Mitglieds der DedA-Familie YghB kodiert (Abb. 4b). V. cholerae exprimiert zwei weitere DedA-Proteine, diese waren jedoch in diesem Screen keine Treffer. Transmembranproteine ​​der DedA-Familie (auch bekannt als PF09335 (SNARE-assoziiertes Golgi-Protein)) sind in allen drei Lebensbereichen konserviert, werden im Allgemeinen für die Homöostase der Zellhülle benötigt und stehen im Verdacht, den PMF-abhängigen Transport zu vermitteln, ihre spezifischen Substrate sind jedoch unbekannt30 ,31. Ähnlich wie bei DUF368 gibt es viele Fälle von Domänenarchitekturen, in denen DedA mit der C55-PP-Phosphatasedomäne PAP2 fusioniert ist, obwohl die meisten DedA-haltigen Sequenzen nur diese Domäne kodieren (Ergänzungstabelle 3). Die synthetische Letalität von vca0040 und yghB wurde durch genetische Depletion und reziprokes Screening synthetischer Transposonen validiert (Abb. 4c, Extended Data Abb. 6a und Ergänzungstabelle 7), und die Überexpression von YghB rettete den alkalischen Defekt von Δvca0040 V. cholerae (Extended Data Abb . 6b).

a, Ein synthetisches Transposon-Screening in Δvca0040 V. cholerae, das log2 mittlere Read Fold Changes (MFC; Schwellenwert ±2) und inverse Mann-Whitney-U-Test-P-Werte (Schwellenwert 100) zeigt. Gepoolte Daten aus zwei unabhängigen Transposon-Bibliotheken. b, Domäneninhalt und vorhergesagte Struktur von V. cholerae VCA0534 (auch bekannt als YghB). c, Wachstum von ΔyghB V. cholerae vca0040-Depletionsstämmen. Ara, Arabinose; Glc, Glukose. d: Spontane Suppressoren von ΔSAOUHSC_00846 sind auf zwei Proteine ​​der DedA-Familie von S. aureus abgebildet, mit vorhergesagten Strukturen (rechts) und spezifischen Promotormutationen, die zur Validierung ausgewählt wurden (fett). e, Rettung von ΔSAOUHSC_00846 durch Expression von SAOUHSC_00901 (0901) oder SAOUHSC_2816 (2816) aus Hybridpromotoren, die den IPTG-induzierbaren Promotor Pspac enthalten, der mit 25-bp- (Konstrukt 1) oder 200-bp- (Konstrukt 2) nativen Promotorstrecken mit den angegebenen verknüpft ist Suppressormutationen (*). f, Faltungsänderung der MHK von Amphomycin für Wildtyp und mutierten S. aureus im Vergleich zur MHK für den Wildtyp bei pH 7 (150 μg ml−1). c,e, Repräsentative Ergebnisse aus n = 3 unabhängigen Experimenten pro Bedingung. f, Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 3 Kulturen pro Stamm oder Zustand.

Wechselwirkungen zwischen DUF368- und DedA-Proteinen wurden auch in S. aureus beobachtet. In mit Alkali angereicherten spontanen Suppressoren von ΔSAOUHSC_00846 S. aureus fanden wir häufige Promotormutationen (und keine kodierende Region) in den Genen, die für die beiden S. aureus-DedA-Proteine ​​(SAOUHSC_00901 und SAOUHSC_02816) kodieren (Abb. 4d). Der Einbau dieser Mutationen in ein durch Isopropyl β-d-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbares System, das eines der beiden DedA-Proteine ​​exprimiert, rettete ΔSAOUHSC_00846 auch ohne Induktion, was darauf hindeutet, dass die isolierten Mutationen die Genexpression erhöhen und das Fehlen von SAOUHSC_00846 kompensieren, wie in V. cholerae (Abb. 4e). Diese genetischen Studien legen nahe, dass Mitglieder der DedA-Familie auch für die C55-P-Translokation erforderlich sind, was mit jüngsten Berichten übereinstimmt, dass eukaryotische DedA-Proteine ​​mit dem Lipidtransport assoziiert sind und bakterielle DedA-Mutanten fehlerhafte C55-Träger-abhängige Lipopolysaccharidmodifikationen aufweisen31,32,33.

Wir stellten die Hypothese auf, dass Mitglieder der DedA-Familie ähnlich wie DUF368-haltige Proteine ​​bedingt funktionieren. Obwohl die Deletion von SAOUHSC_00901 keinen Einfluss auf die Amphomycin-MICs hatte, zeigte die ΔSAOUHSC_02816-Mutante eine moderate säureabhängige Amphomycin-Empfindlichkeit, was die Assoziation von Mitgliedern der DedA-Familie mit der C55-P-Translokation verstärkt und darauf hindeutet, dass sie in niedrigeren pH-Bereichen funktionieren als ihre DUF368-haltigen Gegenstücke (Abb . 4f). Die Empfindlichkeit von ΔSAOUHSC_02816 gegenüber anderen Antibiotika blieb bei jedem pH-Wert unverändert, was die Spezifität der bedingten Amphomycin-Sensibilisierung unterstreicht (Ergänzungstabelle 5). Das Konzept der pH-abhängigen Translokase-Beiträge wird auch durch die alkalische Amphomycin-Empfindlichkeit von lptd4213 E. coli gestützt, das nur DedA-Paraloge und kein verwandtes DUF368-haltiges Protein enthält (Ergänzungstabelle 5). Ein Stamm, dem yghB und vca0040 fehlten, war bei saurem pH-Wert lebensfähig, was darauf hindeutet, dass mindestens ein anderes V. cholerae-Protein die C55-P-Translokation durchführen kann oder dass C55-P unter sauren Bedingungen spontan die Membran durchqueren kann (Extended Data Abb. 6c).

Analysen spontaner Suppressoren von Δvca0040 V. cholerae, die eine charakteristische Koloniemorphologie aufweisen (Extended Data Abb. 7a), ergaben, dass der Bedarf an VCA0040 für die Fitness von V. cholerae zusätzlich zum pH-Wert durch die Na+-Konzentration gesteuert wird. Die Sequenzierung des gesamten Genoms von Suppressorkolonien ohne Zellformdefekte ergab vier Suppressorgene, von denen drei (secD1, secF1 und ppiD) bei der Sec-vermittelten Proteinsekretion eine Rolle spielen (Extended Data, Abb. 7b). Das vierte – yfgO – kodiert für ein Protein unbekannter Funktion aus der AI-2E-Transporterfamilie, deren Mitglieder kürzlich an der Peptidoglycan-Biosynthese und dem Na+/H+-Antiport beteiligt waren34,35. Deletionen von Suppressorgenen retteten die Form- und Peptidoglycan-Defekte von Δvca0040 V. cholerae, obwohl der pH-Wert der stationären Kultur in allen Suppressoren alkalisch war (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 7c, d). In V. cholerae wird SecD-SecF als SecD1-SecF1 und SecD2-SecF2 verdoppelt, Hilfskomplexe, die die SecYEG-Aktivität unterschiedlich an den SMF bzw. PMF koppeln (Extended Data Abb. 7e). Die Aktivität von mindestens einem SecD-SecF-Paar war für die Lebensfähigkeit von V. cholerae erforderlich, und die Löschung von secD2 und secF2 verbesserte den Zellformdefekt der stationären Phase von Δvca0040 nicht (Extended Data Abb. 7c, f, g). Wir stellten zunächst die Hypothese auf, dass eine veränderte Sec-Substratspezifität die Identifizierung von SecD1 und SecF1 als Suppressoren erklären könnte. Das ΔsecDF1-V. cholerae-Proteom blieb jedoch gegenüber dem von Wildtyp-Zellen unverändert, abgesehen von den erwarteten Anstiegen von SecD2 und SecF2, was darauf hindeutet, dass die unterdrückenden Wirkungen des Verlusts von secD1 und secF1 auf einen verringerten Na+-Fluss zurückzuführen waren (Extended Data Abb. 7h). und Ergänzungstabelle 8). Tatsächlich induzierte eine Erhöhung der Na+-, aber nicht der K+-Konzentration alkalisches Wachstum und Peptidoglycan-Defekte in Δvca0040 V. cholerae (Abb. 2a, b und Extended Data Abb. 7i–k). Die Notwendigkeit einer erhöhten Na+-Konzentration für den alkalischen Defekt von DUF368-defizienten V. cholerae schien artspezifisch zu sein, da ΔSAOUHSC_00846 S. aureus, obwohl alkaliempfindlich, durch Na+-Abbau nicht in ähnlicher Weise gerettet wurde (Abb. 2c). Bemerkenswert ist, dass ein ΔyghB V. cholerae-Mutant im Gegensatz zu Δvca0040 bei pH-Werten über 6 nicht ohne Na+ wachsen konnte (Extended Data Abb. 7l, m), was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Na+ verschiedene C55-P-Translokasen unterschiedlich beeinflusst. Zusammengenommen veranschaulichen diese Daten, dass mehrere Umwelteinflüsse den Bedarf an C55-P-Translokase steuern und möglicherweise in verschiedenen Mikroorganismen funktionieren können.

Wir verwendeten ein Kaninchenmodell für Säuglinge (postnataler Tag (P)1–P2), das schwere menschliche Cholera nachahmt37, um die Rolle von VCA0040 bei der Pathogenese zu untersuchen. Typischerweise verwendet dieses Modell alkalische Inokula, um das saure Magenmilieu abzupuffern. Um Inokulumeffekte auszuschließen, führten wir Mischinfektionen mit Inokulumen aus einer 1:1-Mischung aus Wildtyp und Δvca0040 V. cholerae bei pH 7 oder pH 9 durch (Abb. 5a). Unabhängig vom pH-Wert des Inokulums wies die Δvca0040-Mutante im Vergleich zum Wildtyp einen schwerwiegenden Konkurrenzdefekt (100–1.000x) auf (Abb. 5b). Der pH-Wert des Inokulums hatte keinen Einfluss auf die Gesamtbesiedlung oder die Ansammlung von Durchfall-ähnlicher Blinddarmflüssigkeit, dem primären Krankheitsmarker in diesem Modell (Extended Data Abb. 8a, b). Bei einzelnen Infektionen mit fluoreszierendem Wildtyp oder Δvca0040 V. cholerae zeigte die Mutante in allen Darmsegmenten schwere Kolonisierungsdefekte (ca. 1.000-fach) (Abb. 5c, d). Diese Werte überschätzen die tatsächliche Kolonisierung der Mutante, da Kaninchen aus jeder Gruppe gemeinsam gehalten wurden, um Streueffekte auszuschließen, was eine erhebliche Übertragung von Wildtyp-infizierten auf Δvca0040-infizierte Kaninchen ermöglichte (Extended Data, Abb. 8c). Die Übertragung erklärt wahrscheinlich, warum die Ansammlung von Blinddarmflüssigkeit bei Δvca0040-infizierten Kaninchen geringer war als bei Wildtyp-Kaninchen, aber keine statistische Signifikanz erreichte (Abb. 5e). Die von gemischten und einfach infizierten Tieren gesammelte Blinddarmflüssigkeit war stark alkalisch (pH 8,5–9) (Abb. 5f). Die Bildgebung von Blinddarmflüssigkeitsproben von Δvca0040-infizierten Kaninchen ergab große, fluoreszierende, kugelförmige Zellen, die denen ähnelten, die in alkalischen Kulturen der Δvca0040-Mutante beobachtet wurden (Extended Data, Abb. 8d). In ähnlicher Weise wurden frisch gewachsene stäbchenförmige Wildtyp- oder Δvca0040-V. cholerae in zellfreien Blinddarmflüssigkeitsproben inkubiert. Δvca0040-Zellen – jedoch keine Wildtyp-Zellen – wurden kugelförmig, wenn sie Blinddarmflüssigkeit ausgesetzt wurden, was darauf hindeutet, dass die VCA0040-Funktion erforderlich ist, um die Form von V. cholerae im alkalischen In-vivo-Milieu aufrechtzuerhalten (Abb. 5g). Ein Infektionsdefekt wurde für ΔSAOUHSC_00846 S. aureus in einem Mausmodell mit intravenöser Infektion und Organabszess nicht festgestellt, in dem der Erreger wahrscheinlich nicht auf alkalische Umgebungen trifft (Extended Data Abb. 9).

a,b, Schema (a) und intestinale Konkurrenzindizes (b) in Mischinfektionsmodellen (n = 6 Kaninchen in jeder Gruppe). SI, Dünndarm. c–e, Schema (c), Anzahl der koloniebildenden Einheiten im Darm (CFU) (d) und Flüssigkeitsansammlungsverhältnis (FAR) (e) bei Einzelinfektionen (n = 3 Kaninchen (Wildtyp) und n = 8 Kaninchen ( Δvca0040)). CF, Blinddarmflüssigkeit; pSI, proximaler Dünndarm; mSI, medialer Dünndarm; dSI, distaler Dünndarm. Offene Kreise zeigen Kaninchen mit Messungen der Nachweisgrenze (LOD) an, bei denen die tatsächliche KBE-Belastung mindestens (für obere LOD-Kreise) oder höchstens (für untere LOD-Kreise) dem aufgetragenen Wert entspricht. Beachten Sie, dass bei zwei Δvca0040-Tieren die Ansammlung von Blinddarmflüssigkeit für die FAR-Berechnung nicht ausreichte und ihnen LOD-Werte zugewiesen wurden (willkürliches Volumen von 25 μl). b,d, Daten sind geometrische Mittelwerte. d, Zweiseitige Mann-Whitney-U-Tests. e, die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung, analysiert mit einem ungepaarten zweiseitigen Student-T-Test. f, pH-Wert der Blinddarmflüssigkeit infizierter Tiere. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SD g. Inkubation von im Labor gezüchteten V. cholerae mit gefilterten Blinddarmflüssigkeitsproben von drei verschiedenen Kaninchen. Repräsentative Bilder von n = 3 Ex-vivo-Inkubationen mit unabhängigen Blinddarmflüssigkeitsproben. Maßstabsbalken, 3 μm. h, Vorgeschlagenes Modell für die mikrobielle C55-P-Translokation und ihre integrierte Kontrolle durch Umwelteinflüsse, das Vorhandensein anderer Translokasen und nicht-Translokasen-bezogene Umweltanpassungsmechanismen.

Quelldaten

Wir schlagen vor, dass DUF368-haltige Proteine ​​​​und Proteine ​​​​der DedA-Familie C55-P-Translokasen sind, die in diesem entscheidenden Schritt der Aufrechterhaltung der Hülle funktionelle Widerstandsfähigkeit bieten (Abb. 5h). Die Identifizierung von C55-P-Transportproteinen schließt vorläufig eine große Lücke im C55-Lipidträger-Recyclingweg. Da unsere genetischen und phänotypischen Daten transportunabhängige Aktivitäten nicht definitiv ausschließen, sind biochemische und strukturelle Studien erforderlich, um zu bestätigen, ob diese beiden Familien diese Funktion tatsächlich ausüben. Die offensichtliche pH- und Ionenabhängigkeit der Beiträge dieser Translokasenkandidaten zur Fitness lässt darauf schließen, dass diese Proteine ​​energetisch kontrolliert werden könnten, da ein wesentlicher Einfluss des pH-Werts auf die mikrobielle Zelle in der Steuerung der transmembranen Ionengradienten liegt. Beispielsweise scheinen DUF368-haltige Proteine ​​unter alkalischen Bedingungen, bei denen der PMF niedrig ist, den größten Beitrag zu leisten38, was darauf hindeutet, dass der DUF368-vermittelte Transport möglicherweise vom SMF oder einem anderen Nicht-PMF-Energiegradienten abhängt, wenn die C55-P-Translokation energieabhängig ist. Es ist auch möglich, dass die Protonierungszustände von C55-P, die wahrscheinlich vom pH-Wert abhängig sind, die maximal aktive Translokase oder den möglichen Beitrag des spontanen C55-P-Scramblings bestimmen. Die Charakterisierung der potenziellen energetischen Abhängigkeit und Direktionalität mehrerer C55-P-Translokasen wird ein wichtiges Thema zukünftiger Studien sein.

Die Konditionalität von DUF368-haltigen Proteinen und Proteinen der DedA-Familie sowie möglicherweise zusätzlicher, noch nicht identifizierter Translokasen könnte den C55-P-Fluss in verschiedenen mikrobiellen Nischen unterstützen (Abb. 5h). Die Empfindlichkeit von Δvca0040 V. cholerae gegenüber einer erhöhten Natriumionenkonzentration und die offensichtliche Anreicherung von DUF368 in anderen bekannten Halophilen wie S. aureus und der Halobakterienklasse der Archaeen (einschließlich H. volcanii) lassen darauf schließen, dass unabhängig von ihrem Energieeintrag DUF368-haltige Proteine ​​vorliegen kann die mikrobielle Anpassung an Umgebungen mit hohem Salzgehalt erleichtern (Ergänzungstabelle 1). Insbesondere die Natrium- und pH-Abhängigkeit des Beitrags von VCA0040 zur Physiologie von V. cholerae spiegelt möglicherweise die starke Fähigkeit des Cholera-Erregers wider, den menschlichen Dünndarm zu besiedeln, wo wahrscheinlich alkalische Bedingungen und Natriumkonzentrationen im millimolaren Maßstab auftreten39. Neben der variablen Erhaltung redundanter Translokasen (Erweiterte Daten, Abb. 10a und Ergänzungstabelle 9) beeinflussen wahrscheinlich auch zusätzliche Eingaben und Anpassungsmechanismen, wie das C55-P-Recycling zur mikrobiellen Fitness beiträgt. Obwohl vca0040 beispielsweise nur unter alkalischen Bedingungen in V. cholerae benötigt wird, ist dieses Gen im verwandten Pathogen Vibrio parahaemolyticus selbst bei neutralem pH-Wert trotz der Erhaltung von yghB und Suppressor-Loci essentiell, was darauf hindeutet, dass der pH-Sollwert bei der Aktivität der DUF368-Familie liegt dominant ist, ist nicht universell40 (Extended Data Abb. 10b). Obwohl DUF368-haltige Proteine ​​– die in einer gleichzeitig veröffentlichten Arbeit in Polyprenylphosphat-Transporter (PopT)-Proteine ​​umbenannt wurden41 – auf Bakterien und Archaeen beschränkt sind, sind Mitglieder der DedA-Familie in Eukaryoten, einschließlich Menschen, weit verbreitet. Daher können unsere Erkenntnisse das Verständnis der Translokation von Polyprenylphosphat (z. B. Dolicholphosphat) in allen Lebensbereichen beeinflussen.

Alle in dieser Studie verwendeten V. cholerae-Stämme sind Derivate von HaitiWT, einer spontanen Streptomycin-resistenten Variante eines klinischen Isolats aus der Haiti-Cholera-Epidemie 201042. Alle in dieser Studie verwendeten S. aureus-Stämme sind Derivate von HG003 (selbst ein Derivat von NCTC8325). Stamm- und Plasmidinformationen sind in der Ergänzungstabelle 10 aufgeführt. Alle konstruierten Stämme wurden durch Sanger-Sequenzierung des Zielorts (Genewiz) verifiziert.

Die folgenden Medien wurden in dieser Studie verwendet: Lysogeny Broth (LB) Miller (10 g l−1 NaCl) (BD Biosciences, USA), M9 Minimalmedium (12,8 g l−1 Na2HPO4·7H2O, 3 g l−1 KH2PO4, 0,5 g l− 1 NaCl, 1 g l−1 NH4Cl, 1 mM MgSO4 und 10 µM CaCl2) (im Labor hergestellt), M63-Minimalmedium (2 g l−1 (NH4)2SO4, 13,6 g l−1 KH2PO4, 0,5 mg l−1 FeSO4·7H2O und 1 mM MgSO4) (US Biologicals), TSB und tryptisches Soja-Agar (TSA) (BD Biosciences). M9 wurde mit 0,4 % Glucose ergänzt und der pH-Wert mit NaOH eingestellt. M63 wurde mit 2 % Glucose ergänzt und der pH-Wert mit KOH eingestellt. Im Allgemeinen wurde LB mit 50 mM Na2HPO4 oder 100 mM Tris gepuffert und der pH-Wert mit NaOH oder HCl eingestellt, und TSB wurde mit 100 mM Bicin gepuffert. Unterschiede in der Pufferung sind in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die Platten wurden mit einer Agar-Endkonzentration von 1,5 % verwendet. Bei Bedarf wurden folgende Antibiotika oder Nahrungsergänzungsmittel verwendet: Streptomycin (200 µg ml−1), Carbenicillin (50 µg ml−1), Kanamycin (50 µg ml−1), Neomycin (50 µg ml−1), Targocil (10). μg ml−1), Erythromycin (10 μg ml−1), Diaminopimelinsäure (DAP, 0,3 mM), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl β-d-galactopyranosid (X-gal, 60 µg ml−1 ), Arabinose (0,2 %) oder IPTG (1 mM).

Für die Routinekultur wurden V. cholerae in ungepuffertem LB bei 37 °C und S. aureus in ungepuffertem TSB bei 37 °C gezüchtet. Kulturen für die Analyse verbrauchter Überstände in V. cholerae wurden durch Subkultivierung von bei 37 °C gezüchteten Übernachtkulturen im Verhältnis 1:1.000 in frischem Medium und 24-stündiges Wachstum bei 30 °C erhalten. Um verbrauchte Überstände zu sammeln, wurden die Kulturen 10 Minuten lang bei 5.000 g und 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein neues Röhrchen überführt, erneut zentrifugiert und mit 0,22-µm-Spritzenfiltern steril in neue Röhrchen filtriert. Die Überstände wurden zur späteren Verwendung bei 4 °C gelagert. Die zur pH-Quantifizierung verwendeten Kulturen wurden vor der Messung 10 Minuten lang bei 5.000 g zentrifugiert. Alle pH-Messungen, einschließlich der Medien- und Pufferformulierung, wurden mit einem pH-Meter (Thermo ORION) durchgeführt, das frisch auf zwei geeignete pH-Standards von 4, 7 und 10 kalibriert wurde.

Informationen zu den Loci, Genomen und Zugangsnummern für Gene und Proteine ​​aus dieser Studie finden Sie in der Ergänzungstabelle 10.

Während unserer Studie, in der hauptsächlich ein zeitgenössischer pandemischer Stamm von V. cholerae (HaitiWT, auch bekannt als KW3, Assembly Accession GCA_001318185.1) verwendet wurde, stellten wir mehrere Annotationsinkonsistenzen mit Genen fest, die angeblich in der Referenz-Shotgun-Assembly (GCA_000006745.1) von konserviert waren N16961 V. cholerae. Im Vergleich zu neueren Long-Read-Assemblys (GCA_003063785.1 und GCA_900205735.1) verfügt die ursprüngliche Assembly von N16961 über etwa 50 ORFs mehr, die aufgrund von Frameshifts, die nicht in den Codierungssequenztabellen enthalten sind, als Pseudogene annotiert sind. Drei davon standen in direktem Zusammenhang mit unserer Studie: (1) lacZ, ein weit verbreitetes Reportergen (VC2338), (2) secF2 (VCA0692) und (3) yghB (VCA0534). Es ist bekannt, dass lacZ in N16961 funktionsfähig ist, und die Neusequenzierung unseres N16961-Laborbestands und die Untersuchung neuerer N16961-Baugruppen bestätigten, dass secF2 und yghB in diesem Stamm tatsächlich intakt sind und die vorhergesagte Rasterverschiebung fehlt. Die „pseudogene“ Annotation von secF2 führte dazu, dass es kürzlich als Safe-Harbour-Locus für die Genombearbeitung in V. cholerae43 verwendet wurde, und bei dieser Methode ist wahrscheinlich Vorsicht geboten. Um die Unterschiede zwischen Stammgenomen zu lösen, ist in der Ergänzungstabelle 11 ein Batch-BLAST-Wörterbuch angegeben, das mutmaßliche VC-Locus-Tags (das herkömmliche V. cholerae-Genbenennungssystem) annotierten HaitiWT-Loci zuordnet.

Um Sequenzen mit annotierten DUF368-Domänen zu identifizieren, wurde Annotree44 mit der Pfam-Kennung PF04018 bei einem Cut-Off-E-Wert von 1x10−30 verwendet. Die Ergebnisse dieser Suche sind in der Ergänzungstabelle 1 enthalten. Taxa mit „_X“-Namen wurden zur einfacheren Analyse manuell in einer einzigen Gruppe zusammengefasst. In einem ähnlichen Versuch verwendeten wir eine HMMER-Suche mit der VCA0040-Sequenz aus Wildtyp-V. cholerae, um annotationsunabhängige Homologe von vca0040 zu identifizieren (Ergänzungstabelle 2). Um die relativen Verteilungen von PF04018, PF09335 (DedA) und PF02673 (BacA) zu analysieren, verwendeten wir Annotree mit einem Cut-Off-E-Wert von 1 × 10−15. Differenzielle Artenlisten mit allen möglichen Erhaltungskombinationen wurden mit einem Venn-Diagrammgenerator (https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) visualisiert und sind in der Ergänzungstabelle 9 enthalten.

Zur Bewertung der Domänenarchitektur verwendeten wir InterProScan (https://www.ebi.ac.uk/interpro) mit DUF368 (PF04018) oder DedA (PF09335) als Abfragen und untersuchten manuell identifizierte Domänenstrukturen. Sequenzen mit für diese Studie relevanten Domänenarchitekturen wurden exportiert und in der Ergänzungstabelle 3 zusammengestellt.

Die Strukturvorhersage der Proteine ​​der DUF368- und DedA-Familie in dieser Studie wurde mit AlphaFold2 auf der öffentlich zugänglichen CoLabFold-Schnittstelle45 durchgeführt. Sequenzen wurden als Monomere modelliert, wobei mmseqs2 für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen verwendet wurde. Die Strukturen wurden mit pLDDT eingestuft und die bestplatzierten Strukturen mit ChimeraX (UCSF) visualisiert.

Die Klonierung von Expressionsvektoren und Deletionsplasmiden wurde durch standardmäßige isotherme Assemblierungstechniken mit 25-bp-Überhängen an jedem Fragment (HiFi DNA Assembly Kit, NEB) durchgeführt. V. cholerae-Mutanten wurden durch Allelaustausch wie zuvor beschrieben mit dem Suizidvektor pCVD442 erzeugt, der 500–700 bp stromaufwärts und stromabwärts gelegene Homologiearme des Ziellocus trug . Als Spenderstamm wurden entweder SM10λpir- oder MFDλpir-E. coli (ein DAP-Auxotroph) mit identischen Konjugationsbedingungen bis auf die DAP-Supplementierung verwendet. Einzelne Crossover-Transkonjuganten wurden durch selektives Ausplattieren auf LB + Streptomycin/Carbenicillin isoliert und über Nacht bei Raumtemperatur in 10 % Saccharose passagiert, um auf Double-Crossover-Ereignisse zu selektieren. Die Zellen wurden auf LB + Streptomycin ausplattiert, erneut auf LB + Streptomycin und LB + Streptomycin/Carbenicillin gepatcht und Streptomycin- und Carbenicillin-resistente Kolonien wurden durch Kolonie-PCR auf erfolgreiche Deletion untersucht. Bei Deletionen, an denen vca0040 beteiligt war, wurde vca0040 immer zuletzt gelöscht und es wurden mindestens zwei Klone pro Stamm gelagert und auf den richtigen Phänotyp überprüft, um einer spontanen Suppressorbildung vorzubeugen. Für die native vca0040-Expression von der ektopischen Chromosomenstelle aus wurde die vollständige Kodierungssequenz zusammen mit 350 bp stromaufwärts kloniert, um den nativen Promotor einzuschließen, und an einer bekannten neutralen genomischen Stelle in V. cholerae eingefügt48. Für die Expression von SAOUHSC_00846 aus dem vca0040-Locus in Δvca0040 V. cholerae verwendeten wir einen Allelaustausch, um die vca0040-Kodierungssequenz durch eine für V. cholerae codonoptimierte SAOUHSC_00846-Sequenz zu ersetzen. Zur Abreicherung von yghB aus Δvca0040 V. cholerae verwendeten wir pAM299, einen Suizidvektor, der das native Allel des Zielgens durch eine Arabinose-induzierbare Kopie ersetzt49. Für Überexpressionsstudien verwendeten wir pBAD18 für die plasmidbasierte Arabinose-Induktion50.

S. aureus ΔSAOUHSC_00846 wurde mit einem einstufigen Allelaustausch unter Verwendung des pTarKO-Plasmids erzeugt, das 1.000 bp stromaufwärts und stromabwärts gelegene Homologiearme des Zielorts trägt, der eine Kanamycin-Kassette flankiert, wie zuvor beschrieben51. Kurz gesagt, das zusammengesetzte pTarKO-Plasmid wurde in elektrokompetentes S. aureus RN4220 tarOoff elektroporiert und für doppelte Crossovers auf TSB mit Kanamycin, Neomycin und Targocil selektiert. Die Kanamycin-Insertion in SAOUHSC_00846 wurde dann mit dem Phagen phi85 in S. aureus HG003 transduziert. Zur Generierung von ΔSAOUHSC_02816 wurde ein identisches Protokoll verwendet. Für ΔSAOUHSC_0901 wurde der Stamm NE1150, der eine Erythromycin-Resistenz-markierte Transposon-Insertion in SAOUHSC_0090152 trägt, als Spender für die Transduktion in HG003 verwendet. Für Überexpressionsstudien verwendeten wir pLOW für die plasmidbasierte IPTG-Induktion53. Zusammengesetzte Plasmide wurden in RN4220-Wildtyp elektroporiert und mit dem Phagen phi85 in S. aureus HG003 ∆SAOUHSC_00846 transduziert.

E. coli MC4100 und sein Derivat lptD4213 sind aufgrund der araD139-Mutation empfindlich gegenüber Arabinose. Um die Verwendung des pBAD-Arabinose-Expressionssystems zu ermöglichen, wurden spontane Arabinose-resistente Mutanten von MC4100 lptd4213 wie zuvor beschrieben isoliert54. Kurz gesagt, Übernachtkulturen von lptD4213 E. coli wurden auf LB + 0,4 % Arabinose-Platten ausplattiert (~10 µl) und bei 37 °C inkubiert. Mutmaßliche Suppressorkolonien wurden auf einer neuen LB + 0,4 % Arabinose-Platte gereinigt. Anschließend wurden Suppressorkolonien auf Wachstum auf LB + 0,4 % Arabinose und kein Wachstum auf M9-Minimalagar + 0,2 % Arabinose gescreent, um Stämme auszuwählen, die gegen Arabinose resistent sind, aber nicht in der Lage sind, Arabinose als Kohlenstoffquelle (d. h. Ara) zu verwenden −/r, aber keine ara+-Kolonien). Um E. coli mit verschiedenen Vektoren zu transformieren, wurden kompetente Zellen gemäß einem Standardprotokoll einem Hitzeschock ausgesetzt und auf LB, ergänzt mit dem/den geeigneten Antibiotikum(en), selektiert.

V. parahaemolyticus RIMD2210633-Mutanten wurden mit einem ähnlichen Allelaustauschsystem wie V. cholerae wie zuvor beschrieben mit dem Suizidvektor pDM440 konstruiert.

Für automatisierte A600-Messungen wurde 1 ml einer gesättigten 37 °C LB-Übernachtkultur von V. cholerae einmal mit 1 ml frischem Medium (spezifisch für das Experiment) gewaschen und in 1 ml frischem Medium resuspendiert. Resuspendierte Bakterien wurden auf eine Ausgangsverdünnung von 1:4.000 verdünnt, indem eine 1:100-Verdünnung in 1 ml frischem Medium und eine anschließende 1:40-Verdünnung in 195 µl spezifischem Medium, aliquotiert in sterile 96-Well-Platten (Corning), durchgeführt wurde. Pro Platte wurden mindestens drei technische Replikate pro Stamm und Medienzustand durchgeführt, zusammen mit mindestens drei leeren Medienvertiefungen. Wachstumskurven wurden in einem BioTek Epoch2-Spektrophotometer unter Schütteln erstellt und 20–24 Stunden lang alle 10 Minuten A600-Messungen durchgeführt. Für die Datenerfassung wurde Gen5 Version 3.08 (BioTek) verwendet. Die Daten für jede Erkrankung wurden über technische und biologische Replikate gemittelt und anhand der A600-Basiswerte korrigiert.

V. cholerae-Stämme wurden über Nacht bei 37 °C in LB unter Zusatz von 50 µg ml−1 Carbenicillin für Stämme mit pBAD18 gezüchtet. Die Kulturen wurden 1:100 in 5 ml LB verdünnt (ergänzt mit 50 µg ml-1 Carbenicillin und 0,2 % Arabinose für Stämme mit pBAD18) und bei 37 °C bis zu einer OD600 von ~0,7 gezüchtet. Die Zellen wurden auf einen A600-Wert von 0,1 normalisiert und dann sechsmal seriell zehnfach verdünnt. Fünf Mikroliter der Verdünnungsreihe wurden auf LB-Agar 100 mM Tris pH 9 (mit 0,2 % Arabinose, 0,2 % Glucose oder ohne Zuckerzusatz) ausplattiert und 18–24 Stunden bei 30 °C inkubiert.

S. aureus-Stämme wurden über Nacht bei 37 °C in TSB unter Zusatz von 10 µg ml-1 Erythromycin für Stämme mit pLOW gezüchtet. Die Kulturen wurden 1:100 in 5 ml TSB verdünnt (ergänzt mit 10 µg ml-1 Erythromycin und 1 mM IPTG für Stämme mit pLOW) und bei 37 °C bis zu einem A600 von ~0,7 gezüchtet. Die Zellen wurden auf einen A600-Wert von 0,1 normalisiert und dann sechsmal seriell zehnfach verdünnt. Fünf Mikroliter der Verdünnungsreihe wurden auf TSA 100 mM Tris pH 9 (mit oder ohne 1 mM IPTG) ausplattiert und 18–24 Stunden bei 37 °C inkubiert.

Für die Bildgebung lebender Zellen zu einem einzigen Zeitpunkt wurden Proben aus den angegebenen Kulturen nach Bedarf konzentriert und auf 0,8 % Agarose-Pads in sterilem PBS auf Glasobjektträgern (Gene Frames, Thermo) immobilisiert und vor der Platzierung des Deckglases getrocknet. Für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen wurden die Proben auf 0,8 % Agarose-Pads in sterilem LB getupft, bevor sie in einer temperaturkontrollierten Kammer mit einer Geschwindigkeit von 1 Bild pro Minute für 3 Stunden Wachstum abgebildet wurden. Die Zellen wurden mit einem Nikon Eclipse Ti-Mikroskop abgebildet, das mit einer Andor NeoZyla-Kamera und einem 100-fachen Ölphase-3-Objektiv mit 1,4 numerischer Apertur (NA) ausgestattet war, unter Verwendung der NIS Elements AR-Software Version 4.6 (Nikon). Die Bildanalyse wurde mit ImageJ Version 1.53 durchgeführt. Bilder in handschriftlichen Abbildungen sind repräsentativ für mindestens 10 Sichtfelder (FOVs) derselben Probe (>200 Zellen) und mehrerer unabhängiger Replikatkulturen, wie angegeben.

Um die Kugelbildung zu induzieren, wurden V. cholerae-Übernachtkulturen bei 37 °C (wobei Δvca0040-Zellen noch weitgehend stäbchenförmig sind) 1:100 in den angegebenen Überstand oder frische Medien rückverdünnt und 4 Stunden lang unter Schütteln bei 200 U/min und 30 °C gezüchtet C. Anschließend wurden die Zellen wie oben beschrieben abgebildet. Für den d/l-Ala-Behandlungstest wurden Übernachtkulturen 90 Minuten lang in frischem LB expandiert, bevor die Aminosäure 1 Stunde lang zugesetzt wurde.

Um die MHK für verschiedene antimikrobielle Wirkstoffe zu quantifizieren, wurden über Nacht bei 37 °C gehaltene Kulturen von V. cholerae im Verhältnis 1:100.000 in frischem Medium verdünnt. Verdünnte Kulturen wurden zum Animpfen von 96-Well-Platten verwendet, die 12 Zweifachverdünnungen des angegebenen Wirkstoffs in LB-Medium in einem Verhältnis von 50 µl Kultur:50 µl Medium enthielten. Pro Stamm und Verdünnung wurden vier technische Wiederholungen durchgeführt. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die MHK-Werte wurden als erste Verdünnung abgelesen, bei der keine Trübung beobachtet wurde. Für Wiederholungstests wurden MICs mit unabhängigen Übernachtkulturen durchgeführt.

Übernachtkulturen (bei 37 °C) von S. aureus oder E. coli wurden auf A600 = 0,01 verdünnt und dann 1:100 in frischem TSB-Medium weiter verdünnt. Verdünnte Kulturen wurden zu Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, die zweifache Verdünnungen des angegebenen Wirkstoffs in TSB-Medium oder TSB-Medium 5 mM Tris, pH 8,5, in einem Verhältnis von 75 µl Kultur:75 µl Medium enthielten. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 30 °C (37 °C für E. coli) unter Schütteln inkubiert. Die MHK-Werte wurden als erste Verdünnung abgelesen, bei der keine Trübung beobachtet wurde.

Für E. coli lptD4213-Vektor-Überexpressions-MICs wurden Übernachtkulturen 1:100 in ungepuffertem LB + Carbenicillin + 0,2 % Arabinose verdünnt. Die Kultur wurde 1,5–2 Stunden lang ausgewachsen und auf A600 = 0,01 verdünnt. Dies wurde weiter auf A600 = 0,0001 verdünnt und 75 µl der Kultur wurden zu 75 µl einer Reihenverdünnung des Arzneimittels hinzugefügt. Verdünnte Kulturen wurden zu Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, die zweifache Verdünnungen des angegebenen Wirkstoffs in LB, 5 mM Tris, pH 8,5, 1 mM CaCl2, mit 0,2 % Glucose oder 0,2 % Arabinose in einem Verhältnis von 75 µl Kultur: 75 µl Medium enthielten . Die Platten wurden wie oben beschrieben inkubiert und abgelesen.

Für V. cholerae wurden Stämme über Nacht bei 37 °C in LB + 200 µg ml−1 Streptomycin gezüchtet. Für jede Probe wurden 500 µl der Übernachtkultur gesammelt und 5 Minuten lang bei 5.000 g zentrifugiert, einmal mit 500 µl des entsprechenden Mediums gewaschen und in 500 µl des entsprechenden Mediums resuspendiert. Diese Kultur wurde dann zu 50 ml M63-Medium (pH 7 mit 100 mM NaCl, pH 8 mit 100 mM NaCl oder pH 8 mit 0 mM NaCl), ergänzt mit 2 % Glucose und 200 µg ml−1 Streptomycin, gegeben und bei 30 °C inkubiert Ungefähr 6 Stunden lang, bis der A600 ~0,5 erreichte. Die Bakterien wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 6.000 g und 4 °C gesammelt und in 1,5 ml 1 × PBS resuspendiert. Die Resuspension wurde tropfenweise in 1,5 ml kochende 5 %ige SDS-Lösung gegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gekocht und nach Abschalten der Heizung weitere 2 Stunden gerührt.

Für S. aureus wurden Stämme über Nacht bei 37 °C in 3 ml TSB gezüchtet. 500 µl der Übernachtkultur wurden zu 100 ml TSB ohne pH-Einstellung oder TSB + 100 mM Bicin pH 8,5 gegeben und etwa 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, bis der A600-Wert 0,5 erreichte. Die Bakterienzellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5.000 g und 4 °C gesammelt und in 1,5 ml 1 × PBS resuspendiert. Resuspendierte Proben wurden wie bei V. cholerae gekocht.

Peptidoglycan wurde aus gekochten Proben wie zuvor für gramnegative und grampositive Bakterien55 beschrieben extrahiert. Nach dem Kochen wurde das Zellwandmaterial durch Ultrazentrifugation pelletiert und mit Wasser gewaschen. Saubere Sacculi wurden mit Muramidase (100 μg ml–1) verdaut und lösliche Muropeptide unter Verwendung von 0,5 M Natriumborat, pH 9,5, und 10 mg ml–1 Natriumborhydrid reduziert. Anschließend wurde der pH-Wert der Proben mit Phosphorsäure auf 3,5 eingestellt. UPLC-Analysen wurden auf einem Waters UPLC-System durchgeführt, das mit einer ACQUITY UPLC BEH C18-Säule, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 150 mm (Waters Corporation) ausgestattet und durch A204 nm identifiziert wurde. Muropeptide wurden mithilfe eines linearen Gradienten von Puffer A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) zu Puffer B (0,1 % Ameisensäure in Acetonitril) getrennt. Die Identifizierung einzelner Peaks erfolgte durch Vergleich der Retentionszeiten und -profile mit validierten Chromatogrammen. Die relative Menge jedes Muropeptids wurde berechnet, indem die Peakfläche eines Muropeptids durch die Gesamtfläche des Chromatogramms dividiert wurde. Die Häufigkeit von Peptidoglycan (Gesamtpeptidoglycan) wurde durch Normalisierung der Gesamtfläche des Chromatogramms auf A600 ermittelt. Der Vernetzungsgrad wurde wie zuvor beschrieben berechnet56.

Für V. cholerae wurden Stämme über Nacht bei 37 °C in LB + 200 µg ml−1 Streptomycin gezüchtet. Für jede Probe wurden 500 µl der Übernachtkultur gesammelt und 5 Minuten lang bei 5.000 g zentrifugiert, einmal mit 500 µl des entsprechenden Mediums gewaschen und in 500 µl des entsprechenden Mediums resuspendiert. Achtzig Mikroliter dieser Resuspension wurden dann zu 8 ml M63-Medium (pH 7 mit 100 mM NaCl, pH 8 mit 100 mM NaCl oder pH 8 mit 0 mM NaCl), ergänzt mit 2 % Glucose und 200 µg ml-1 Streptomycin, gegeben und inkubiert bei 30 °C für etwa 6 Stunden, bis der A600 ~0,5 erreichte. Bakterienzellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5.000 g und 4 °C gesammelt, zweimal mit 1 ml eiskalter 0,9 % NaCl gewaschen und in 200 µl MilliQ-Wasser resuspendiert. Die Resuspension wurde 30 Minuten lang gekocht, 15 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert und der Überstand wurde filtriert und analysiert.

Für S. aureus wurden Stämme über Nacht bei 37 °C in 3 ml TSB gezüchtet. Achtzig Mikroliter der Übernachtkultur wurden zu 8 ml TSB ohne pH-Einstellung oder TSB + 100 mM Bicin pH 8,5 gegeben und etwa 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, bis der A600 etwa 0,5 erreichte. Anschließend wurden die Kulturen wie bei V. cholerae verarbeitet.

Die Quantifizierung der löslichen UDP-M5-Muropeptidspiegel mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) gefilterter Überstände wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt57. Der Nachweis und die Charakterisierung löslicher Muropeptide mittels LC-MS wurden auf einem UPLC-System durchgeführt, das mit einem Xevo G2/XS Q-TOF-Massenspektrometer (Waters Corporation) verbunden war, unter Verwendung zuvor beschriebener Bedingungen57. Die UDP-M5-Spiegel wurden durch Integration der Peakflächen aus extrahierten Ionenchromatogrammen (EICs) des entsprechenden m/z-Werts quantifiziert. Die UDP-M5-Häufigkeit wurde wie für das Gesamtpeptidoglycan auf Kultur A600 normalisiert.

S. aureus- oder V. cholerae-Zellen wurden über Nacht bei 37 °C in 10 ml TSB bzw. LB pH 7 gezüchtet. Die Zellen wurden gewaschen, durch Zentrifugation gesammelt, im Versuchsmedium (z. B. TSB oder LB bei einem bestimmten pH-Wert) resuspendiert und mit einer Verdünnung von 1:200 in 200 ml des Versuchsmediums inokuliert. Sobald ein A600-Wert von 0,6 erreicht war, wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und in einer French Press aufgeschlossen. Zelltrümmer wurden verworfen und der Überstand in einer Beckman Optima Max TL-Ultrazentrifuge 15 Minuten lang bei 270.000 g zentrifugiert. Anschließend wurden Lipide aus den Membranpellets wie unten beschrieben extrahiert.

Die Membranlipide von S. aureus und V. cholerae wurden weitgehend wie zuvor beschrieben extrahiert58. Membranpellets wurden in 500 µl PBS resuspendiert. Dann wurden 1,25 ml Methanol und 625 µl Chloroform hinzugefügt. Die Suspension wurde 2 Minuten lang bei Raumtemperatur gevortext und die Homogenate wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 7.100 g zentrifugiert. Den Überständen wurden 625 µl Chloroform und 625 µl PBS zugesetzt und sie wurden vortexiert und 10 Minuten lang bei 4 °C und 7.100 g zentrifugiert, um die Chloroformphase von der PBS-Methanol-Phase zu trennen. Anschließend wurde die Chloroformphase isoliert und vakuumgetrocknet. Getrocknete Pellets, die die gereinigten Membranlipide enthielten, wurden in 300 µl der UPLC-Lösungsmittel für die mobile Phase (50 % H2O mit 0,1 % Ameisensäure + 50 % Isopropanol mit 0,1 % Ameisensäure) resuspendiert. Um sicherzustellen, dass diese Methode in der Lage ist, C55-OH und C55-P zu extrahieren, wurden 200 nmol jedes Lipidstandards (Larodan) zu frischen gereinigten Membranproben gegeben, bevor sie dem Extraktionsprotokoll unterzogen wurden.

In UPLC-Lösungsmitteln für die mobile Phase resuspendierte Lipidextrakte wurden durch UPLC auf einer Umkehrphasen-C18-Säule Kinetex C18 UPLC-Säule analysiert. Partikelgröße 1,7 µm, Porengröße 100 Å, 50 × 2,1 mm. Die Trennung der Lipide erfolgte mit einem Gradienten aus H2O mit 0,1 % Ameisensäure für Lösungsmittel A und Isopropanol mit 0,1 % Ameisensäure für Lösungsmittel B, einer Flussrate von 0,4 ml/min mit einem linearen Gradienten über 8 Minuten und einer Säulentemperatur von 60 °C C und einer Wellenlänge von 210 nm. Die Identifizierung von C55-OH und C55-P basierte auf der Retentionszeit der Standards und ihre Häufigkeit wurde im Verhältnis zur gesamten Peakfläche jedes Chromatogramms berechnet. Zur Berechnung des Mutanten-Wildtyp-Verhältnisses wurden Proben aus unabhängigen Kulturen, die am selben Tag gezüchtet wurden, zufällig gepaart. Für die UPLC-Datenerfassung und -analyse wurde die Chromatographiedatensoftware Empower3 (Waters) verwendet.

Zur Synthese von Ampho-FL wurden 5 mg Amphomycin (Cayman Chemical) in 200 µl Dimethylformamid (DMF) gelöst und mit 7 µl Triethylamin kombiniert. Separat wurden 3 mg Fluorescein-C5,6-NHS (Thermo Fisher, USA) in 200 µl DMF gelöst und dann zur Amphomycinlösung gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde in einem gleichen Volumen DMSO verdünnt und durch Umkehrphasen-HPLC (Agilent 1260 Infinity) unter Verwendung einer C18-Säule mit stationärer Phase (Luna 5 µM C18(2) 100 Å, 250 × 10 mm) gereinigt. Die HPLC-Bedingungen waren wie folgt: Phase A: Wasser (0,1 % Ameisensäure); Phase B: Acetonitril (0,1 % Ameisensäure). Phase B: 0–2 Min., 50 %; 2–15 Min., linearer Gradient 50–100 %, 15–17 Min., 100 %. Die Wellenlänge des Detektors wurde auf 254 nm eingestellt. Die Flussrate betrug 4,7 ml min−1. Die Mischung aus konjugierten Fluorescein-C5,6-Produkten eluierte nach 9 Minuten. HPLC-Eluate wurden in einem 50-ml-Rundkolben gesammelt, durch Rotationsverdampfung konzentriert, mit DMSO in ein tariertes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und lyophilisiert, was 1,7 mg Ampho-FL (M+1 = 1.649,23) ergab.

Für die Ampho-FL-Markierung wurden Übernachtkulturen von S. aureus HG003 Wildtyp oder ∆SAOUHSC_00846 1:100 in frischem TSB-Medium verdünnt, gepuffert bei pH 6 (100 mM MES), 7 (100 mM Tris) oder 8,5 (100 mM Bicin). ). Die neuen Kulturen wurden auf A600 = 0,5 gezüchtet. 1 ml der Kultur wurde 5 Minuten lang bei 1.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 µl 1× Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) pH 9 resuspendiert. 98 Mikroliter der Mischung wurden in ein neues Röhrchen überführt und mit 2 µl 10 mg ml-1 Ampho-FL-Konjugat in DMSO kombiniert . Die Mischung wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert, dreimal mit 500 µl 1× TBS pH 9 gewaschen und in 100 µl 1× TBS pH 9 resuspendiert. Zehn Mikroliter Bakterien wurden dann zu einer 0,8 %igen Agarose gegeben Pad in TBS pH 9 mit 1 μg ml−1 Propidiumiodid auftragen und wie oben beschrieben abbilden. Um eine Verzerrung bei der FOV-Auswahl zu vermeiden, wurde das Pad bei ausgeschaltetem FITC-Kanal gescannt, um FOVs ausschließlich auf Basis der Zelldichte auszuwählen. Bakterienzellen wurden mit DIC bei einer Belichtung von 30 ms abgebildet und das Ampho-FL-Signal wurde mit dem FITC-Filter bei einer Belichtung von 1 s erfasst. Die Fluoreszenzintensität von Ampho-FL wurde mit ImageJ Version 1.53 quantifiziert. FITC-Signalprofile wurden durch das Zeichnen von Halbierungslinien durch sich teilende Propidiumiodid-negative Zellen erzeugt. Das FITC-Signal wurde im Hintergrund links von den Zellen (A), am linken Wandpeak (B), an den Mittelwänden (C), am rechten Wandpeak (D) und im Hintergrund aufgezeichnet rechts von den Zellen (E). Das durchschnittliche Signal wurde durch (B + C + D)/4 − (A + E)/2 berechnet.

Die Erzeugung von Transposonbibliotheken im Δvca0040- und ΔyghB-Hintergrund wurde wie zuvor für HaitiWT V. cholerae15 beschrieben durchgeführt. Stämme wurden an SM10λpir E. coli konjugiert, die den Donor-Transposon-Vektor pSC189 trugen. Aufgrund des moderaten Konjugationsdefekts von Δvca0040 verwendeten wir im Vergleich zu den anderen Bibliotheken eine fünffache Konzentration der Konjugationsreaktionen. Die Reaktionen wurden auf 245 mm2 LB + Streptomycin/Kanamycin-Agarplatten ausplattiert, um V. cholerae-Transkonjuganten zu isolieren, und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Es wurden zwei unabhängige Δvca0040- und ΔyghB-Bibliotheken generiert, die jeweils aus etwa 200.000 Kolonien bestehen und bei einem A600 von ~10 in LB + 25 % Glycerin gelagert sind. Für synthetische Transposon-Insertionssequenzierungsanalysen wurde ein gefrorenes Aliquot jeder Bibliothek aufgetaut und für die genomische DNA-Extraktion mit dem Wizard-Kit (Promega) verwendet. DNA-Bibliotheken wurden auf identische Weise wie frühere Transposon-Insertionssequenzierungsexperimente unserer Gruppe erstellt und auf einer hauseigenen MiSeq-Plattform (lllumina)18 sequenziert. Lesevorgänge wurden wie zuvor beschrieben mit der Transposon-Insertion-Sequenzierungsanalyse-Pipeline Con-ARTIST unter Verwendung von Python Version 3.0 und Matlab Version 918 zugeschnitten, zugeordnet und verarbeitet. Um synthetische Interaktionsorte zu identifizieren, verwendeten wir den Wildtyp als „Eingabe“-Bibliothek und die Mutante als „Ausgabe“-Bibliothek während der Analyse.

Für transkriptomische Analysen wurden dreifache Wildtyp- und Δvca0040 V. cholerae 37 °C-Übernachtkulturen 1:100 in frisches LB-Medium rückverdünnt und 8 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Nach 8 Stunden wurden die Proben mikroskopisch überprüft, um den Beginn der Kugelbildung in den Mutantenproben sicherzustellen. Zu diesem Zeitpunkt wurden 2 ml jeder Kultur zentrifugiert (5 Minuten bei 5000 g und Raumtemperatur). Die RNA wurde mit Trizol-Reagenz (Sigma-Aldrich) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die isolierte RNA wurde dann mit DNase behandelt und durch Ethanolpräzipitation gemäß einem Standardprotokoll erneut isoliert. Die Qualität der RNA-Proben wurde mit einem Bioanalyzer überprüft, um RIN-Werte > 6 zu bestätigen. Die Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek wurde vom Microbial Genome Sequencing Center (Pittsburgh) durchgeführt. Die RNA-Sequenzierungsanalyse wurde weitgehend wie beschrieben durchgeführt59. Die Lesevorgänge wurden mit Bowtie2 (Version 2.4.1)60 auf das KW3-Genom von V. cho\lerae (NCBI-Assembly GCA_001318185.1) abgebildet. Anschließend wurde eine Lesematrix für jede Probe mit featureCounts von Rsubread (Version 2.4.3)61 generiert. Die gelesenen Matrizen wurden dann mit DESeq2 (Version 1.30.1) unter Verwendung der Standardeinstellungen in R (Version 4.0.3) analysiert, um unterschiedlich exprimierte Gene zu identifizieren. Die Datenverkleinerung wurde mit ashr62 durchgeführt.

Für proteomische Analysen wurden dreifache 37 °C-Wildtyp- und ΔsecDF1-V. cholerae-Übernachtkulturen gezüchtet, wie unter „RNA-Sequenzierung“ beschrieben. Nach 8 Stunden Wachstum wurden Ganzzellpelletproben (WCP) hergestellt, indem 1 ml Zellen 5 Minuten lang bei 5.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, einmal in frischem LB gewaschen, schockgefroren und bei –80 °C aufbewahrt wurden. Die massenspektrometrische Analyse wurde vom Thermo Fisher Center for Multiplexed Proteomics (TCMP) an der Harvard Medical School gemäß Standardprotokollen durchgeführt. WCP-Proben wurden einem vollständigen Proteomik-Workflow mit Fraktionierung unterzogen. Pelletierte Zellen wurden zunächst in 8 M Harnstoff, 200 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinpropansulfonsäure (EPPS) und 1 % SDS mit Phosphatase- und Proteaseinhibitoren lysiert. Anschließend wurden die Proben mit DTT reduziert und mit Iodacetamid alkyliert. Alkylierte Proteine ​​wurden mit Methanol/Chloroform ausgefällt und in 200 mM EPPS, pH 8, resuspendiert und nacheinander mit 1:50 LysC und 1:100 Trypsin verdaut. Die Peptide wurden mit TMT16-Reagenzien markiert, gepoolt und nach einem einfachen Umkehrphasenprotokoll in 12 Fraktionen fraktioniert. Anschließend wurden die Fraktionen getrocknet, auf einer mit C18 gefüllten Tischspitze gereinigt und zur Analyse in ein Probenfläschchen für die Massenspektrometrie eluiert. Die Proben wurden in 5 % Acetonitril/5 % Ameisensäure resuspendiert und mittels LC-MS3 auf einem Orbitrap Lumos-Massenspektrometer unter Verwendung einer 180-minütigen MS3-Methode analysiert. Peptide wurden im Orbitrap nachgewiesen (MS1) und quantifiziert (MS3) und in der Ionenfalle sequenziert (MS2). MS2-Spektren wurden mit dem COMET-Algorithmus anhand des KW3-Proteoms von V. cholerae, seines umgekehrten Komplements und bekannter Kontaminanten durchsucht. Spektralübereinstimmungen wurden mithilfe der Target-Decoy-Strategie in Kombination mit einer linearen Diskriminanzanalyse auf eine Falscherkennungsrate von 1 % gefiltert. Proteine ​​wurden aus Peptiden mit einem summierten Signal-Rausch-Schwellenwert von >150 und einer Isolationsspezifität von >0,5 quantifiziert.

Um eine unabhängige Isolierung spontaner Suppressoren sicherzustellen, wurde der Stamm Δvca0040 11 Mal aus verschiedenen Konjugationsreaktionen neu abgeleitet. Von jedem Kolonie-PCR- und Zellformfehler-verifizierten Δvca0040-Klon wurden Kolonien mit mutierter Morphologie (klein und vollständig blau) auf LB + Streptomycin/X-Gal-Platten erneut auf neue LB + Streptomycin/X-Gal-Platten ausgestrichen und gezüchtet 36–48 h bei 37 °C. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Von den Tertiärplatten wurde eine einzelne Kolonie mit Wildtyp-Morphologie (groß mit einem weißen Hof) erneut ausgestrichen, um einen stabilen Suppressor-Phänotyp zu bestätigen. Suppressoren wurden durch Mikroskopie von 30 °C-Nachtkulturen überprüft, um die Umkehrung des Zellformdefekts zu bestätigen, und durch Kolonie-PCR verifiziert, um das Fehlen von vca0040 in ihrem Genom zu bestätigen. Validierte Suppressoren wurden über Nacht gezüchtet und genomische DNA wurde wie oben beschrieben extrahiert. Die Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek wurde entweder intern durchgeführt oder an das Microbial Genome Sequencing Center (Pittsburgh) ausgelagert. Für die interne Sequenzierung des gesamten Genoms wurde die gDNA mit dem Nextera XT-Bibliotheksvorbereitungskit (Illumina) markiert und mit einem Barcode versehen, die Qualität von BioAnalyzer überprüft und auf einer MiSeq-Plattform bis zu einer Tiefe von mindestens dem 20–50-fachen des V. cholerae-Genoms sequenziert ( ~4 Mbit/s). Die Genomassemblierung und Variantenidentifizierung wurde mit CLC Genomics Workbench 12 (Qiagen, Deutschland) durchgeführt. Varianten wurden gegen ein zusammengesetztes HaitiWT-Isolat gefiltert, das mit demselben Arbeitsablauf neu sequenziert wurde. Mutationen wurden als Suppressoren zugeordnet, wenn sie in >90 % der Lesevorgänge vorhanden waren und nicht in einer bekanntermaßen schlecht kartierten oder stark repetitiven Region wie einem tRNA-Locus auftraten. Für das sekundäre Screening in secDF2-Δvca0040-Bakterien wurde die Δvca0040-Deletion drei unabhängige Male im ΔsecD2- oder ΔsecF2-Hintergrund neu abgeleitet. Suppressoren wurden identisch mit denen im elterlichen Δvca0040-Hintergrund isoliert und sequenziert.

Mehrere 2-ml-Kulturen von S. aureus HG003 ∆SAOUHSC_00846 wurden über Nacht bei 37 °C in TSB gezüchtet. Einhundertneunzig Mikroliter von jeder unabhängigen Übernachtkultur wurden dann separat auf TSA 100 mM Tris pH 9-Platten ausplattiert (wo das Wachstum des Mutanten vollständig gehemmt ist) und 24 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet. Suppressoren wurden durch erneutes Ausstreichen auf TSA 100 mM Tris pH 9-Platten bestätigt. Validierte Suppressoren wurden über Nacht gezüchtet und genomische DNA wurde wie oben beschrieben extrahiert. Die Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Variantenidentifizierung wurden wie oben für V. cholerae beschrieben durchgeführt.

Orale Infektionen von Säuglingskaninchen mit V. cholerae wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt15. Ein bis zwei Tage alte weiße Neuseeland-Kaninchen (Charles River Laboratories) wurden für die Dauer des Experiments zusammen mit ihren Muttertieren in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Anlage mit 12-stündigen Hell-/Dunkel-Zyklen (16–22 °C) gehalten C, 50 % Luftfeuchtigkeit). Inokula wurden durch Zentrifugieren einer Spätexponentialphasenkultur (A600 0,6–0,8) von V. cholerae und Resuspendieren in 2,5 % Natriumbicarbonat hergestellt. Um den pH-Wert der Inokula zu variieren, wurde der pH-Wert des Natriumbicarbonats unmittelbar vor der Resuspension mit NaOH oder HCl auf pH 9 oder 7 eingestellt. Infizierte Jungtiere wurden mit 109 KBE V. cholerae in einem 500 μl-Schlundsondenvolumen oral gefüttert, zu ihrem Muttertier zurückgebracht und 16–20 Stunden nach der Infektion überwacht, als sie durch Isofluran-Inhalation und intrakardiale Injektion von 20 mÄq Kaliumchlorid getötet wurden . Dünndarmsegmente und der Blinddarm wurden durch Präparation isoliert, durch Perlenperlen in PBS homogenisiert und Verdünnungen wurden zur Koloniezählung auf geeignete Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden nach einer Inkubation über Nacht bei 30 °C gezählt. LOD-Messungen wurden berechnet, indem eine einzelne Kolonie mit der niedrigsten (untere Grenze) oder höchsten (obere Grenze) Verdünnung unterstellt wurde, bei der eine Kolonie vernünftigerweise hätte identifiziert werden können, was bedeutet, dass LOD-Werte Proben sind, bei denen der wahre Wert höchstens entweder (für untere Grenze) beträgt LODs) oder zumindest (für höher gebundene LODs) den Grenzwert. Während der Präparation des Blinddarms wurde eine 28G-Nadel verwendet, um rohe Blinddarmflüssigkeit zu extrahieren. Für die CFU-Ausplattierung und Bildgebung wurde eine Probe roher Blinddarmflüssigkeit entnommen und der Rest 2 Minuten lang bei 21.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und die Überstände für nachfolgende Analysen bei –20 ° C eingefroren. Für Tests zur Inkubation von Blinddarmflüssigkeit wurden Übernachtkulturen von V. cholerae 1:100 in Blinddarmflüssigkeit rückverdünnt und vor der Bildgebung 4 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet.

S. aureus HG003 (Wildtyp) und KanR-markiertes ΔSAOUHSC_00846 wurden über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Die Kulturen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, 1:1 mit 50 % Glycerin kombiniert und in mehreren Aliquots gefroren bei –80 °C gelagert. Bei Infektionen wurde ein Aliquot aufgetaut und in PBS auf eine Dichte von ~3 × 107 KBE ml−1 verdünnt. 100 Mikroliter wurden in die Schwanzvene von 8 bis 9 Wochen alten weiblichen Swiss-Webster-Mäusen injiziert. Die Mäuse wurden täglich überwacht und in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Einrichtung mit 12-stündigen Licht-/Dunkelzyklen (20–24 °C, 50 % Luftfeuchtigkeit) gehalten. An den Tagen 2 und 5 nach der Infektion wurden die Mäuse durch Isofluran-Inhalation und Zervixluxation getötet und Herz, Lunge, rechte Niere, Leber und Milz entnommen. Die Organe wurden mit Edelstahlkügelchen in PBS homogenisiert und auf TSA und TSA + Kanamycin (TSAK) plattiert und über Nacht inkubiert, um jeweils den Gesamt-ΔSAOUHSC_00846-KBE zu zählen. LOD-Berechnungen wurden wie für Experimente mit Säuglingskaninchen durchgeführt.

Alle Tierarbeiten in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden zur Verwendung und Pflege von Labortieren und mit der Genehmigung des Brigham and Women's Hospital IACUC (Protokoll-Nr. 2016N000334 für Säuglingskaninchen und Protokoll-Nr. 2016N000416 für Mäuse) durchgeführt.

Die verwendeten statistischen Tests und Replikationsinformationen werden in den Abbildungslegenden, den relevanten Methodenabschnitten und der Berichtszusammenfassung angegeben. Sofern nicht anders angegeben, wurden Experimente mit mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt und entweder repräsentative Ergebnisse oder aggregierte Daten (Mittelwert ± Standardabweichung) angezeigt. Die Stichprobengrößen waren statistisch nicht vorgegeben. Während der gesamten Studie waren die Forscher hinsichtlich der Probenidentität nicht blind und die Randomisierung der Tiere in Infektionsexperimenten erfolgte wie in der Berichtszusammenfassung beschrieben. Alle Wiederholungen führten zu ähnlichen Ergebnissen. Statistische Analysen wurden in Prism 9 (Graphpad) und Microsoft Excel 2020 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzdaten wurden im NCBI Sequence Read Archive unter den BioProject-Zugangscodes PRJNA868324 (V. cholerae-Suppressor-Genomsequenzierung), PRJNA868332 (V. cholerae-RNA-Sequenzierung), PRJNA877769 (V. cholerae-Transposon-Insertionssequenzierung) und PRJNA877773 (S. aureus-Suppressor) hinterlegt Genomsequenzierung). Proteomics-Daten wurden in MassIVE unter dem Zugangscode MSV000090217 hinterlegt. Alle weiteren Daten sind auf Anfrage bei den jeweiligen Autoren uneingeschränkt frei erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01AI-042347 an MKW und F31AI156949 an KH), dem Howard Hughes Medical Institute (MKW), dem National Sciences and Engineering Research Council of Canada (PGSD3-487259-2016 an BS) und Swedish Research unterstützt Council (FC), Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse (FC), Laboratory of Molecular Infection Medicine Sweden (FC) und Kempe Foundation (FC) Wir danken C. Wegler im Cava-Labor für technische Unterstützung bei der C55-P-Analyse; Mitglieder des Waldor-Labors für Kommentare und Diskussionen während der Studie; D. Rudner für die Koordinierung der Einreichung; das Thermo Fisher Scientific Center for Multiplexed Proteomics an der Harvard Medical School, insbesondere R. Rodrigues, für seine Unterstützung bei der Proteomik; und das Microbial Genome Sequencing Center (MiGS) für Unterstützung bei der RNA-Sequenzierung und der Sequenzierung des gesamten Genoms. Schaltpläne und Modellfiguren in Abb. 1, 3 und 5 und erweiterte Datenabbildungen. 5, 7 und 9 wurden mit BioRender.com generiert. Dieser Artikel unterliegt der Open Access to Publications-Richtlinie des HHMI. HHMI-Laborleiter haben der Öffentlichkeit zuvor eine nicht-exklusive CC BY 4.0-Lizenz und HHMI in ihren Forschungsartikeln eine unterlizenzierbare Lizenz gewährt. Gemäß diesen Lizenzen kann das vom Autor akzeptierte Manuskript dieses Artikels sofort nach Veröffentlichung unter einer CC BY 4.0-Lizenz frei verfügbar gemacht werden.

Brandon Sit

Aktuelle Adresse: Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Veerasak Srisuknimit

Derzeitige Adresse: Abteilung für Biochemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, Thailand

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Brandon Sit, Veerasak Srisuknimit, Emilio Bueno

Abteilung für Infektionskrankheiten, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, USA

Brandon Sit, Veerasak Srisuknimit, Franz G. Zingl, Karthik Hullahalli und Matthew K. Waldor

Abteilung für Mikrobiologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Brandon Sit, Veerasak Srisuknimit, Franz G. Zingl, Karthik Hullahalli und Matthew K. Waldor

Labor für molekulare Infektionsmedizin Schweden (MIMS), Abteilung für Molekularbiologie, Umeå Center for Microbial Research (UCMR), Universität Umeå, Umeå, Schweden

Emily Good & Philip Cava

Abteilung für Immunologie und Infektionskrankheiten, Harvard TH Chan School of Public Health, Boston, MA, USA

Matthew K. Waldor

Howard Hughes Medical Institute, Bethesda, MD, USA

Matthew K. Waldor

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BS, VS und MKW haben die Studie konzipiert. BS, VS und EB entwarfen unter Aufsicht von FC und MKWBS Experimente, die In-vitro- und In-vivo-V.-cholerae-Experimente sowie bioinformatische Analysen und Datenvisualisierung durchführten. VS führte In-vitro-Experimente mit S. aureus, E. coli lptd4213 und synthetisiertes Ampho-FL durch. EB führte eine biochemische Peptidoglycan- und C55-P-Extraktion und -Quantifizierung durch. Das FGZ führte In-vitro-Experimente durch und half bei der Datenreplikation. KH identifizierte spontane Suppressoren von V. cholerae, führte das In-vivo-S.-aureus-Experiment durch und half bei der Datenreplikation. Alle Autoren beteiligten sich an der Datenanalyse und -interpretation. BS und MKW haben das Manuskript unter Mitwirkung und Bearbeitung aller anderen Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Felipe Cava oder Matthew K. Waldor.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Carol Gross, Anant Menon und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a): Daten zur Transposon-Insertionssequenzierung bei Säuglingskaninchen, reproduziert von Hubbard et al. (Lit. 15) identifiziert vca0040 (rot) als Determinante für die Darmkolonisierung durch V. cholerae. Das tcp-Operon, von dem bekannt ist, dass es für die Kolonisierung entscheidend ist, ist blau hervorgehoben. Ein repräsentatives Kaninchen (#403) ist abgebildet. Inverse p-Werte wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test ohne Anpassungen für mehrere Vergleiche ermittelt. Die dargestellten Schwellenwerte sind die gleichen wie in Abb. 4a. (b und c): Domänenstruktur, Locus-Tags, Zugangsnummern (b) und Ausrichtung (c) von V. cholerae und S. aureus DUF368-haltigen Proteinen. Die Ausrichtung wurde mit T-COFFEE durchgeführt. IN: vorhergesagte, dem Zytosol zugewandte Sequenz. HEL: vorhergesagte Transmembran-Helix-Sequenz. OUT: vorhergesagte nach außen gerichtete Sequenz. (d und e): Phylogenetische Konservierung von DUF368-Domänen (PF04018). (d): Erhaltung auf Familienebene (blaue Linien), gruppiert nach Stamm (farbige Bögen). Ausgewählte, gut vertretene Phyla sind beschriftet. Blaue Linien sind nicht skaliert und geben keine Auskunft über die Anzahl oder Diversität der DUF368-Sequenzen innerhalb der Familie. (e): Aufschlüsselung der DUF368-Erhaltung auf Familienebene.

Die DUF368-haltigen Proteine ​​von V. cholerae (links) und S. aureus (rechts) wurden mit AlphaFold2 modelliert und mit ChimeraX visualisiert. (a): Multiple Sequence Alignment (MSA)-Abdeckung (links) und pLDDT (Konfidenzwert, rechts) pro Position für jedes Protein aus AlphaFold2. (b): Gesamtbandstrukturen, gefärbt vom N-Terminus (violett) bis zum C-Terminus (rot). (c und d): Karten des elektrostatischen Oberflächenpotentials (c) und der Lipophilie (d), erstellt mit den Standardeinstellungen von ChimeraX. V. cholerae-Panels sind der Übersichtlichkeit halber aus Abb. 1c und d wiedergegeben. Elektrostatische Farbskala: -10 bis 10 kcal/(mol·e). Lipophilie-Farbbalken: relative molekulare Lipophilie, berechnet von ChimeraX. (e): MSA-Abdeckung, pLDDT-Diagramm sowie Band- und elektrostatische Oberflächenansichten des DUF368-Proteins aus Haloferax volcanii (HVO_RS12060).

(a): CFU-Plattierungszeitverlauf von WT und Δvca0040 V. cholerae. Der Beginn der stationären Phase erfolgt nach 6 Stunden. (b): Phasenkontrastbildgebung von WT, Δvca0040 und Δvca0040 + vca0040 V. cholerae in Übernachtkulturen unter den angegebenen Bedingungen. (c): Phasenkontrast-Bildgebungs-Zeitverlauf der angegebenen Stämme, die für den angegebenen Zeitraum in LB bei 30 °C gezüchtet wurden. (d): Zeitrafferaufnahme von Δvca0040-Zellen, immobilisiert auf einem Agarose-Pad aus einer 30 °C-Übernachtkultur. Die Bilder wurden über einen Zeitraum von 3 Stunden Wachstum aufgenommen. (e): Bildgebung von V. cholerae, behandelt mit normalem, gekochtem (10 Min.) oder gefiltertem (<3K MW Cutoff) zellfreiem, verbrauchtem Überstand für 4 Stunden bei 30 °C. (f): Bildgebung von V. cholerae, behandelt mit Vehikel (DMSO) oder 3 mM D- oder L-Ala in frischem LB für 4 Stunden bei 30 °C. a: Mittelwert ± SD von n = 3 unabhängigen Kulturen pro Stamm. b, c, e, f: repräsentative Bilder von n = 3 unabhängigen Kulturen pro Stamm/Bedingung. d: repräsentativer Zeitraffer einer einzelnen Zelle, repräsentativ für >20 kugelförmige Bakterien über n = 3 separate Sichtfelder aus einer einzelnen Übernachtkultur. Maßstabsbalken: 3 (b,c,f) oder 5 (d,e) µm.

(a und b): Alkalisches Wachstum von Δvca0040 V. cholerae mit pBAD18-Vektoren, die (a) SAOUHSC_00846 aus S. aureus oder (b) HVO_RS12060 aus H. volcanii exprimieren. (ce): Zusammensetzungs- und Vernetzungsanalyse in den angegebenen V. cholerae-Stämmen beim angegebenen pH-Wert in M63-Medium. Suppressor: Δvca0040/ΔsecDF1. (f und g): Gleich wie ce für S. aureus, gewachsen unter den angegebenen Bedingungen. a, b: repräsentative Daten von n = 3 Kulturen pro Stamm/Bedingung. cg: Mittelwert ± SD aus n = 3 Kulturen pro Stamm/Bedingung. Die statistische Analyse wurde mit einfaktoriellen ANOVAs mit mehreren Tukey-Vergleichstests (ce) oder zweiseitigen t-Tests für ungepaarte Studenten (f, g) durchgeführt.

(ad): RNAseq von Δvca0040 V. cholerae, mit Schema (a), Bestätigung der Kugelbildung durch Bildgebung bei der Probenentnahme (b), Hauptkomponentenanalyse der RNAseq-Daten (c) und MA-Plot der analysierten Sequenzen (d) ( n = 3 unabhängige Kulturen pro Stamm). Während der RNAseq-Analyse wurde ein willkürlicher Fold Change (FC)-Grenzwert von 4 implementiert, und Gene mit FC-Werten unterhalb des p-Wert-Schwellenwerts von 0,05 werden rot hervorgehoben. pgpB und vca0040 sind gekennzeichnet. (e und f): UPLC-Spuren (e) und Quantifizierung der relativen Häufigkeit von C55-P (f) in V. cholerae, das bei dem angegebenen pH-Wert gezüchtet wurde. (g): Ampho-FL-gefärbter S. aureus, gewachsen bei pH 6, 7 oder 8,5. (h): Quantifizierung des Ampho-FL-Färbesignals bei verschiedenen pH-Werten, wie in g gezeigt. Symbole stellen die mittlere Ampho-FL-Intensität von n = 1–8 einzelnen Bakterienclustern in unabhängigen Kulturen dar. Als Kontrollen dienten Einzelkulturen mit einem pH-Wert von 8,5, da für dieses Experiment eine neue Charge Ampho-FL verwendet wurde. e, g: repräsentative Daten von n = 3 Kulturen pro Stamm/Bedingung (außer n = 1 Kultur bei pH 8,5 in g). f, h: n = 3 unabhängige Kulturen. Die statistische Analyse wurde mit (d) Wald-Tests in der DESeq2-Pipeline mit mehreren Vergleichsanpassungen oder (f, h) zweiseitigen t-Tests für ungepaarte Studenten durchgeführt. Maßstabsbalken, 5 µm.

(a): Synthetisches Transposon-Insertionsscreening in ΔyghB V. cholerae. Die P-Werte wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test (MWU) ohne Anpassung für mehrere Vergleiche ermittelt. MFC: mittlere fache Änderung der Leseabdeckung zwischen ΔyghB und WT. (b): Wachstum von Δvca0040 V. cholerae-exprimierenden Vektoren mit Arabinose-induzierbaren Genen auf regulären LB-Platten (links), LB pH 9-Platten (Mitte) und LB pH 9 + Arabinose-Platten (rechts). (c): Wachstum von V. cholerae, dem vca0040 und/oder yghB oder beides fehlt, auf LB-Platten mit pH 6. LB wurde mit 100 mM MES gepuffert und der pH-Wert mit HCl eingestellt. a: gepoolte Daten aus n = 2 unabhängigen Transposon-Bibliotheken. b, c: repräsentative Bilder von n = 3 Kulturen pro Stamm/Bedingung.

(a): Repräsentative Kolonien von WT, Δvca0040 und Suppressor V. cholerae auf LB+X-gal-Platten. Weiße Pfeile zeigen Suppressoren an. (b): Spontane Suppressormutationen von Δvca0040 V. cholerae. SecD1, SecF1 und PpiD sind Teil der Proteinsekretionsmaschinerie von V. cholerae. Farbiger Text zeigt Suppressoren aus einem sekundären Screen in ΔsecD2/Δvca0040 (blau) oder ΔsecF2Δvca0040 (rot) V. cholerae an. Sternchen: Stoppcodon. (c): Phasenkontrastbildgebung von LB-Kulturen der angegebenen Stämme über Nacht bei 30 °C im Δvca0040-Hintergrund. Maßstabsbalken, 3 μm. (d): pH-Wert der LB-Kultur über Nacht bei 30 °C der angegebenen Stämme. (e): SecDF1- und SecDF2-Funktionen in V. cholerae. Mögliche SecDF-Funktionen: Kopplung des Ionenimports mit der SecA-ATPase-Stimulation (unterer Pfeil) oder Sec-Substratführung in das Periplasma (oberer Pfeil). (f): Synthetische Letalität von secD2 in ΔsecD1 V. cholerae unter Verwendung des pAM299-Suizidvektors für die Ara-abhängige secD2-Expression. (g): Wachstum der angegebenen Stämme in M63-Medium mit zugesetztem NaCl oder KCl. (h): Wasserfalldiagramm zum Vergleich von ΔsecDF1 mit dem Proteom von WT V. cholerae, sortiert nach Proteinfaltenänderung (FC). (i): Wachstum von Δvca0040 V. cholerae in [Na+]-variierenden (oben) oder [K+]-variierenden (unten) M63-Medien bei pH 6, 7 oder 8. (j und k): Wachstum von WT (j) oder Δvca0040 (k) V. cholerae in M63 pH 8 mit einem Bereich von [NaCl]. 100 mM NaCl-Kurven von i werden zum Vergleich in j und k repliziert. (l und m): Wachstum der angegebenen V. cholerae-Stämme auf ungepuffertem (l) oder pH 6 (m) LB mit normalem (~170 mM) oder ohne zugesetztem NaCl. a: repräsentatives Bild von n = 11 unabhängigen Suppressorstämmen. c, f, l, m: repräsentative Daten von n = 3 Kulturen pro Stamm/Bedingung. d: bedeutet ± SD von n = 3 Kulturen pro Stamm. g, i, j, k: Mittelwert ± SD von mindestens 3 technischen Replikaten einzelner Kulturen (repräsentativ für n = 3 Kulturen pro Stamm/Bedingung). h: gepoolte Daten zum Vergleich von n = 4 unabhängigen Kulturen jedes Stammes.

(a): Gesamt-KBE bei Mischinfektionen mit unterschiedlichem pH-Wert des Inokulums (jeweils n = 6 für pH 7 und 9). (b): Flüssigkeitsakkumulationsverhältnis (FAR) bei Mischinfektionen mit unterschiedlichem pH-Wert des Inokulums. (c): Repräsentative Dünndarm-CFU-Platten von Einzelinfektionen, die die Übertragung von WT V. cholerae (grau durchscheinende Kolonien) von WT-infizierten Kaninchen auf Δvca0040-infizierte Kaninchen im selben Wurf zeigen. Beachten Sie, dass Δvca0040-Kolonien (weiße Pfeile) heller und kleiner als WT-Kolonien sind, wodurch sie visuell unterscheidbar und zählbar sind. (d): Direkte Bildgebung von GFP+ V. cholerae in CF-Proben mit Einzelinfektion. Große GFP-helle Kugeln sind wahrscheinlich Δvca0040-Zellen in Gegenwart von übertragenen, stäbchenförmigen WT-Zellen. Maßstabsbalken, 3 μm. a: Geometrische Mittelwerte, analysiert mit zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests. b: Mittelwert ± SD, analysiert mit dem zweiseitigen t-Test eines ungepaarten Schülers. c, d: repräsentative Bilder von n = 3 WT und n = 7 Δvca0040 einfach infizierten Kaninchen.

Quelldaten

(a): Schematische Darstellung von IV-Infektionen und Probenentnahme-Workflow. TSA-Zählungen geben die Gesamt-KBE-Belastung durch S. aureus an, während TSAK-Zählungen die Belastung durch ΔSAOUHSC_00846 anzeigen. Pro Zeitpunkt wurden N = 5 Mäuse verwendet (n = 10 insgesamt). (b): Rohe CFU-Zahlen von TSA- und TSA + Kanamycin (TSAK)-Platten. Liegt kein Wettbewerbsdefekt vor, sollten die TSAK-Werte 50 % der Werte auf den TSA-Schildern betragen (und liegen daher im log10-Diagramm sehr nahe beieinander). (c): Verhältnis von ΔSAOUHSC_00846 (KanR) koloniebildenden Einheiten (KBE) zur gesamten S. aureus-KBE am Tag 2 (links) und Tag 5 (rechts) nach der Infektion. Die gepunktete Linie zeigt den mittleren Ausgangsanteil von n = 2 technischen Replikatplatten des Inokulums. Offene Kreise stellen die Nachweisgrenze (LOD) dar. Beachten Sie, dass Proben mit KBE-Zahlen unterhalb der LOD nicht aufgezeichnet wurden. b: geometrische Mittel. c: bedeutet ± SD.

Quelldaten

(a): Venn-Diagramm der Annotree-Ausgaben auf Artenebene für die PFAM-Abfragen PF04018 (DUF368), PF09335 (DedA) und PF02673 (BacA/UppP). Von den 30.255 Bakterienarten in der Annotree-Datenbank enthalten voraussichtlich 29.416 (97,2 %) mindestens eines der drei Proteine. Eine Liste der Arten in jedem Segment des Venn-Diagramms ist in der Ergänzungstabelle 9 aufgeführt. Dies ist wahrscheinlich auch eine Überschätzung der Anzahl der Arten, denen eine dieser drei Domänen aufgrund von Sequenzdivergenz und möglicherweise unzureichender PFAM-Annotation fehlt. Beispielsweise gehört der obligat intrazelluläre Erreger Rickettsia rickettsii (GCA_000018225.1) zur Gruppe der dreifach fehlenden Bakterien, bei manueller Kuration ist jedoch bekannt, dass er Peptidoglycan enthält und eine annotierte DedA-Kodierungssequenz aufweist, was möglicherweise auf eine PFAM-Annotationsverzögerung zurückzuführen ist. Interessanterweise scheinen Mycoplasma-Arten, die kein Lipopolysaccharid oder Peptidoglycan haben (und daher möglicherweise nicht von der C55-P-Translokation abhängig sind), tatsächlich dreifach abwesend zu sein, mit Ausnahme einiger ausgewählter Mitglieder, die nur ein DUF368-haltiges Protein enthalten. (b): Wachstum von V. parahaemolyticus, dem das DUF368-haltige Protein VPA1624 fehlt, bei neutralem und saurem pH-Wert. VPA1624 interagiert genetisch mit den secDF1-Loci von V. parahaemolyticus, da die Löschung dieser ursprünglich in V. cholerae identifizierten Suppressoren den vpa1624-depletierten Stamm rettet. Ara: Arabinose, Glc: Glucose. Repräsentative Daten von n = 3 unabhängigen Kulturen pro Stamm/Bedingung.

Bakterien- und Archaeenkladen mit PF04018-haltigen Proteinen. Annotree wurde verwendet, um Arten mit einer annotierten DUF368-Domäne darzustellen und zu identifizieren. Jede Registerkarte der Tabelle stellt eine andere Ebene der Bakterienklassifizierung dar (Stamm>Ordnung>Familie>Gattung>Art). Archaeengruppen werden auf der Registerkarte „Archaea“ zusammengefasst.

Homologe von VCA0040 in Bakterien. HMMER wurde verwendet, um homologe Sequenzen zu VCA0040 in der Uniprot-Datenbank zu identifizieren. Jede Art wird einmal aufgeführt.

Bemerkenswerte Domänenarchitekturen von DUF368- und DedA-haltigen Proteinen. Sequenzen wurden durch Durchsuchen von InterProScan mit den PF-Familienbezeichnungen für DUF368 (PF04018) und DedA (PF09335) erhalten.

RNAseq von Δvca0040 V. cholerae während der Kugelbildung. Für die 40 am häufigsten hochregulierten Gene in Δvca0040 wurde eine manuelle Kuration der subzellulären Lokalisierung mit SignalP und pSortb durchgeführt. P-Werte wurden durch den von DESeq2 durchgeführten Wald-Test mit Anpassungen für mehrere Vergleiche ermittelt.

MHK-Daten für V. cholerae, S. aureus und E. coli. Die Daten für jeden Organismus sind in einzelne Arbeitsblätter unterteilt. Beachten Sie, dass die S. aureus-Daten in zwei Arbeitsblätter aufgeteilt sind, eines für die Charakterisierung von WT gegenüber Δ0846 („SA“) und eines für WT gegenüber Δ0846, Δ2816 und Δ0901 („SA_dedA“). Alle V. cholerae-Daten befinden sich unter „VC“ und alle E. coli lptd4213-Daten unter „EC_lptd4213“.

Screening auf synthetische Transposon-Insertion in Δvca0040 V. cholerae. Beachten Sie, dass intergene Regionen (IG_) und Regionen mit <5 informativen Stellen (mögliche Transposon-Insertionsstellen) nicht analysiert wurden. Treffer auf der zweiten Registerkarte wurden mit einem inversen MWU-p-Wert > 100 als Schwellenwert bewertet, bevor nach der mittleren log2-fachen Änderung sortiert wurde.

Screening der synthetischen Transposon-Insertion in ΔyghB V. cholerae. Beachten Sie, dass dieser Datensatz nicht wie in der Ergänzungstabelle 6 gefiltert wurde.

Multiplex-vergleichende Proteomik von Ganzzell-WT und ΔsecDF1 V. cholerae. Die Faltungsänderung wurde berechnet, indem die durchschnittliche normalisierte relative Häufigkeit von Proteinen in ΔsecDF1 durch die von WT dividiert wurde.

Konservierung von PF04018, PF09335 und PF02763 in Bakterienarten. Die Tabelle wurde durch Annotree-Abfragen für alle möglichen Kombinationen der drei Proteinfamilien erstellt. Das Blatt „Master“ listet alle Organismen auf Artenebene mit der angegebenen Domänenkombination auf. Das Blatt „Modellarten“ listet ausgewählte Mikroorganismen von besonderem Interesse auf und kann zum Nachschlagen jeder bestimmten Art in der Referenztabelle verwendet werden. Interessante Arten sollten von BLAST manuell auf ihre Anwesenheit oder Abwesenheit bestätigt werden, um Fehlannotations- oder Nichtannotationsproblemen vorzubeugen.

In dieser Studie verwendete Stämme und Vektoren sowie genomische Informationen. Alle aufgeführten Stämme oder Vektoren können beim Hauptkontakt ([email protected]) angefordert werden.

BLAST-Wörterbuch zur Zuordnung mutmaßlicher VC-Namen zu HaitiWT V. cholerae loci. Alle kodierenden Sequenzen von HaitiWT wurden als Abfragen in einem Batch-BLAST des N16961 V. cholerae-Proteoms verwendet. Der höchste Treffer nach E-Wert wurde ausgewählt und der VC-Name automatisch zugewiesen. Da Batch-BLAST jedoch unabhängig von der Konfidenz einen Treffer ausgibt, ist bei Verwendung dieses Wörterbuchs immer noch eine manuelle Kuratierung für bestimmte Loci erforderlich.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sit, B., Srisuknimit, V., Bueno, E. et al. Undecaprenylphosphat-Translokasen verleihen eine bedingte mikrobielle Fitness. Natur 613, 721–728 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05569-1

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Eingegangen: 02. März 2022

Angenommen: 17. November 2022

Veröffentlicht: 30. November 2022

Ausgabedatum: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05569-1

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